本发明专利技术涉及miR‑182的模拟物及抑制物和其应用，所述miR‑182的模拟物为SEQ ID NO.1，miR‑182的抑制物为SEQ ID NO.2，其结合miR‑182的位点为TGCCAAA；二者均能够调节miR‑182与Caspase 3的3′‑UTR结合水平，从而起到调节细胞凋亡、细胞成活和增殖作用，本发明专利技术还公开了一种包含上述抑制物核苷酸序列的重组表达载体，并且进一步公开了上述模拟物及抑制物在制备调节肝细胞增殖的药物中的应用。本发明专利技术有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。
MiR 182 mimics and inhibitor and its recombinant expression vector and its application
The present invention relates to miR 182 mimics and inhibitors and its application, simulation 182 the miR SEQ ID NO.1, miR 182 SEQ ID inhibitor NO.2, the combination of miR 182 were TGCCAAA; two were able to adjust the miR 182 and Caspase 3 the 3 'UTR combined water level, so as to regulate cell apoptosis, cell survival and proliferation, the invention also discloses an inhibitor containing the nucleotide sequence of the recombinant expression vector of drug and further discloses the simulation and inhibitor in preparing regulating liver cell proliferation in. The invention is conducive to providing efficient, large throughput screening and evaluation platform and means for developing related drugs, and will greatly promote the application of miRNA in tumor prevention, diagnosis and treatment.
【技术实现步骤摘要】
miR-182的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种miR-182的模拟物和一种抑制物及该抑制物的重组表达载体及其用途。
技术介绍
肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。据报道，关于miR-182的研究主要与肝细胞癌的发生与形成密切相关，且经常在一些肿瘤中发生中高表达，是一个与癌症相关的miRNA。通过实验发现，miR-182促进大鼠正常肝细胞的增殖，并对肝再生的前期启动有显著影响。miR-182的模拟物体内促细胞增殖的原理是用基因转染的方法将模拟物导入受体细胞，该模拟物与Caspase3的3′-UTR结合，导致Caspase3表达水平降低，从而阻遏凋亡作用，促进细胞增殖；miR-182的抑制物体内发挥作用的原理是设计并构建重组载体，其内含有miR-182的抑制物核苷酸序列，用基因转移的方法将重组载体导入受体细胞，通过载体过表达miR-182的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列与miR-182定点结合，从而抑制miR-182与Caspase3的3′-UTR结合，Caspase3表达水平增加，从而促进细胞凋亡。
技术实现思路
本专利技术提供了一种miR-182的模拟物及抑制物，该模拟物及抑制物可用于调节Caspase3蛋白表达，以及调节肝细胞增殖或凋亡的基础医学和临床医学的研究，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种miR-182的模拟物，所述模拟物为SEQIDNO.1。本专利技术还提供了一种能抑制miR-182结合Caspase3的3′-UTR的抑制物，所述抑制物选自Caspase3的3′-UTR中长约700～1000bp区段；所述抑制物与miR-182的结合位点为TGCCAAA。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述抑制物为SEQIDNO.2。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′末端和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为XhoI和NotI对应的酶切位点；所述XhoI酶切位点位于5′末端，所述NotI酶切位点位于3′末端。在根据本专利技术的一个实施方案中，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素报告酶。本专利技术还提供了上述的miR-182的模拟物在制备用于促进肝再生的药物中的应用；优选的，所述促进肝再生的药物为抑制细胞凋亡相关蛋白Caspase3表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的药物。本专利技术还提供了上述的miR-182的抑制物在制备用于促进肝细胞凋亡的药物中的应用；优选的，所述抑制肝肿瘤的药物为促进细胞凋亡相关蛋白Caspase3表达和/或抑制肝细胞增殖相关蛋白表达的药物。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术提供的miR-182的模拟物可以用于降低Caspase3蛋白的表达，以及促进肝细胞增殖的基础医学和临床医学的研究；本专利技术提供的miR-182的抑制物及其重组表达载体可以用于增加Caspase3蛋白的表达，以及促进肝细胞凋亡的基础医学和临床医学的研究；二者有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进miRNA在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。附图说明图1为miR-182的高通量检测结果与qRT-PCR检测结果的比较。灰色线为高通量检测结果；黑色线为qRT-PCR检测结果；图2为用含miR-182抑制物的重组表达载体转染BRL-3A细胞的MTT检测结果；图3a为BrdU免疫组化检测miR-182的mimic对BRL-3A细胞增殖的影响；图3b为BrdU免疫组化检测细胞增殖结果统计；图4为miR-182的mimic和inhibitor对BRL-3A细胞周期进程的影响；图5a为miR-182与Caspase3的3′-UTR结合位点示意图；图5b为miR-182的mimic或inhibitor分别与Caspase3的3′-UTR共转染BRL-3A细胞后双荧光素酶的检测结果。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材实验大鼠为成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8：00-20：00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partialhepatectomy，PH)与假手术对照(shamoperation，SO)各9组。PH组按Higgins和Anderson方法进行，SO组除不切除肝叶外，其他同PH。手术后2、6、12、24、30、36、72、120和168h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如RNALater)中，于-20℃保存备用。实施例2：miRNAs的高通量测序取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按mirVanamiRNAIsolationKit(Ambion，USA)操作指南提取和纯化miRNAs。用琼脂糖凝胶电泳(180V，0.5h)检测总RNA质量，分别通过260nm和280nm波长测定RNA的浓度和纯度。实验用样品的28S和18SrRNA亮度比约为2∶1，OD260/OD280≥2.0。miRNAs的定性和定量分析由上海伯豪生物技术公司进行，测序方法为单端SolexamicroRNA-Seq测序，读长36nt。将测序得到的miRNAs序列与miRNAs库比对，确定miRNAs的种类和丰度。实施例3：大鼠肝再生相关miRNAs用单端SolexamicroRNA-Seq高通量测序法，从实验组(PH)和假手术组(SO)的0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h等10个时间点的大鼠再生肝中检测出425条miRNAs，经过ratio值分析表明，信号值大于20的126条miRNAs中，39条发生了有意义的表达变化。其中，31条的ratio值≥对照2倍，视为有意义表达上调。4条的ratio值≤对照2倍，视为有意义表达下调。4条在有的时间点上调，有的时间点下调，视为上/下调。T-检验表明，上述39条发生了有意义表达变化的miRNAs中，23条miRNAs与肝再生相关(表1)。表1大鼠肝再生中发生有意义转录变化的miRNAs注：表示ratio值≥2；表示ratio值≤0.5；表示P＜0.05，推测为大鼠肝再生相关microRNAs。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR‑182的模拟物，其特征在于，所述模拟物为SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种miR-182的模拟物，其特征在于，所述模拟物为SEQIDNO.1。2.一种能抑制miR-182结合Caspase3的3′-UTR的抑制物，其特征在于，所述抑制物选自Caspase3的3′-UTR中长约700～1000bp区段；所述抑制物与miR-182的结合位点为TGCCAAA。3.如权利要求书2所述的抑制物，其特征在于，所述抑制物为SEQIDNO.2。4.如权利要求书2和3所述的抑制物，其特征在于，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为XhoI和NotI对应的核苷酸序列；所述XhoI酶切位点位于5′末端，所述Not...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐存拴，张春艳，耿小芳，李晶晶，孟竺，石金保，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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