一种能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒的细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒的细胞系及其构建方法。本发明专利技术将构建含有HAV5 E1基因的载体转染至ST细胞后，用嘌呤霉素筛选得到细胞系ST‑E1。将含有PAV3 E1Blarge基因和I‑SceI基因的克隆载体与pMD2.G和psPAX2共转染至293T细胞，收集培养上清，感染ST‑E1细胞，用潮霉素进行筛选，得到细胞系ST‑E1‑E1B

A cell line capable of proliferation and packaging deletion of E1 gene recombinant porcine adenovirus type 3 and construction method thereof

The present invention discloses a cell line capable of proliferation and packaging of recombinant porcine adenovirus type 3 lacking E1 gene and its construction method. The present invention will construct HAV5 E1 gene plasmid was transfected into ST cells, with puromycin screened cell lines ST E1. PAV3 containing E1Blarge and I gene SceI gene cloning vector with pMD2.G and psPAX2 were transfected into 293T cells. The supernatant was collected and infected ST E1 cells, using hygromycin screening by cell line ST E1 E1B

【技术实现步骤摘要】
一种能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒的细胞系及其构建方法
：本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒的细胞系及其构建方法，应用于ΔE1PAV3的口服疫苗和基因递送系统研究。
技术介绍
：猪3型腺病毒（PAV3）为健康猪肠道分离病毒，与目前普遍使用的人5型腺病毒（HAV5）相比，PAV3具有更高的安全性、更强的免疫原性、可口服途径免疫以及可逃逸机体存在猪腺病毒免疫干扰的诸多优势。充分发挥PAV3以上优势的前提是具备缺失E1基因（ΔE1PAV3）的感染性克隆和高效包装细胞系。腺病毒载体（Advectors），特别是人腺病毒5型（HAV5）已经广泛应用于基因治疗、疫苗生产和病毒治疗领域。目前，用于治疗的腺病毒载体大多是复制缺陷型载体，即基因组缺失E1区或E1和E3区都缺失的腺病毒载体，增加改造腺病毒载体外源片段的插入容量。由于E1区在不同腺病毒间无特异性，因此目前通用稳定表达HAV5E1基因的细胞系来包装各种一代代非人类腺病毒载体。E3区基因编码产物功能是对抗宿主机体的防御系统，但是对病毒在体外的复制是非必需的，所以在构建拯救细胞系时也是非必需的。尽管缺失E1和E3区可使腺病毒获得约9kb的插入容量，但是病毒复制必须基因E1的缺失会导致病毒包装的失败。因此，E1缺失的腺病毒需要在稳定表达E1基因的细胞系统中才能拯救。如E1缺失的HAV5在稳定表达E1基因的293系列细胞中才能拯救出病毒。尽管用HAV5E1区可以成功拯救多种人腺病毒，但是仅仅依靠HAV5E1区并不能高效拯救所有E1缺失的腺病毒。其原因在于E1区缺失后，同时会影响到腺病毒E4区的功能，进一步影响到病毒基因组转录的起始。尽管HAV-5E1区的多个ORF无病毒特异性，可用于替代其他腺病毒的E1区的相应区域，但是E1区的E1Blarge具有腺病毒特异性，该特异性主要由E1Blarge与E4区ORF的结合的特异性决定，即只有腺病毒自身的E1Blarge与自身的E4区ORF互作才可启动高效的病毒基因组转录，一旦用其他病毒的E1Blarge替换腺病毒的E1Blarge，E1区缺失腺病毒的拯救效率则会受到很大影响，甚至造成病毒包装失败。目前，腺病毒载体包装细胞系主要是针对人腺病毒，而拯救缺陷型猪腺病毒的细胞系很少。为了利于缺陷型猪腺病毒载体的改造及其包装，增加外源片段插入量，构建包装猪3型腺病毒载体的细胞系尤为重要。此外，VR1BL是目前已知的可以拯救缺失E1区猪3型腺病毒的细胞系。该细胞系是由稳定表达HAV5E1基因的VIDOR1细胞，经转入PAV3E1BLarge基因，因为PAV-3E1BLarge基因对猪腺病毒的复制是必须的，所以只有能够表达PAV3E1BLarge基因的细胞系，才可以实现缺失E1区的PAV3才可以包装成功。考虑到野生型PAV3除了可在VR1BL中增殖外，还可在猪的睾丸细胞（ST）中高效增殖，本研究基于二代慢病毒包装系统构建可稳定表达HAV5E1和PAV3E1Blarge和I-SceI的细胞系——ST-E1-E1Blarge-ISceI。
技术实现思路
：本专利技术为了解决上述
技术介绍
中的技术缺陷，提供一种能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系，利用此细胞系增殖缺失E1区重组PAV3，可使病毒滴度明显高于VR1BL细胞；利用该细胞系能够包装缺失E1重组PAV3。本专利技术提供的能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系，命名为ST-E1-E1Blarge-ISceI，保藏编号为：CGMCCNO.12259，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2016年04月08日；分类命名为：猪睾丸细胞。基于本专利技术所述的能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系能够增殖缺失E1区重组PAV3，可使病毒滴度明显高于VR1BL细胞，因此，本专利技术还请求保护，所述的能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系CGMCCNO.12259在增殖缺失E1重组猪3型腺病毒中的应用，以及其在制备猪3型腺病毒疫苗中的应用。同时，本专利技术还请求保护一种制备缺失E1基因猪3型腺病毒疫苗的方法，其特征在于，是将缺失E1基因猪3型腺病毒接种至细胞系CGMCCNO.12259上制备得到，以及由该方法制备得到的一种缺失E1基因猪3型腺病毒疫苗。本专利技术还提供构建该种能增殖和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系的方法。为实现本专利技术的目的，采用如下技术方案：本专利技术的一种能增殖和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)构建表达HAV5E1的细胞系ST-E1；(2)构建表达PAV3E1Blarge和I-SceI的穿梭质粒；(3)构建稳定表达PAV3E1Blarge和I-SceI的细胞系ST-E1-E1Blarge-ISceI；(4)评价稳定表达IsceI/PAV3E1Blarge基因的ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞系。其中，步骤(1)中的表达HAV5E1细胞系ST-E1按以下方法得到：将已拥有国外惠赠的含有HAV5E1基因的载体pTG4671转染ST细胞，用嘌呤霉素筛选，得到抗嘌呤霉素的ST-E1细胞系。步骤(2)中的表达PAV3E1Blarge和I-SceI的穿梭质粒按以下方法得到：从VR1BL细胞中扩增目的片段PAV3E1Blarge基因，通过酶切连接方法，构建中间质粒pCMV-3HA-3NLS-ISceI-2A-PAV3E1B，通过相应酶切连接方法最终构建成功慢病毒克隆载体。步骤(3)中PCR扩增所用的引物为：5’-ATTGGTACCTCATCACCATCATCATCACGGGTCCATGTTCCCTGCTGGAGGCGCGAATG-3’；5’-ACGTCTAGAGTCGACTCAGTCATCGTCATCGCTGAAC-3’。步骤(3)中的细胞系ST-E1-E1Blarge-ISceI按以下方法得到：将慢病毒包装克隆载体与包装质粒pMD2.G和psPAX2共转染至293T细胞，收集包装成功的慢病毒，用293T细胞测定慢病毒的滴度；慢病毒感染ST-E1细胞，用潮霉素筛选得到抗潮霉素的ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞系；用WesternBlot方法检测筛选细胞克隆的PAV3E1Blarge和I-SceI的表达。上述方法得到的细胞系能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒。本专利技术所构建的细胞系ST-E1-E1Blarge-ISceI通过步骤(4)，与专利保护的VR1BL细胞相比，ST-E1-E1Blarge-ISceI可实现ΔE1PAV3（带有报告基因EGFP）的成功包装和高效增殖，且增殖能力显著高于VR1BL细胞。本研究成果为可极大促进基于ΔE1PAV3的口服疫苗和基因递送系统研究。附图说明：图1为表达PAV3E1Blarge和I-SceI的穿梭质粒的构建流程图。图2为本专利技术中所使用的慢病毒包装克隆载体pTRIP-3HA-3NLS-ISCEI-2A-PAV3E1Blarge-IRES-Hygro的结构示意图。图3为本专利技术的ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞系w本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够增殖和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系，命名为ST‑E1‑E1Blarge‑ISceI，保藏编号为：CGMCC NO.12259，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2016年04月08日。

【技术特征摘要】
1.一种能够增殖和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系，命名为ST-E1-E1Blarge-ISceI，保藏编号为：CGMCCNO.12259，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为：2016年04月08日。2.如权利要求1所述的能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系CGMCCNO.12259在增殖缺失E1重组猪3型腺病毒中的应用。3.如权利要求1所述的能够增殖和和包装缺失E1重组猪3型腺病毒的细胞系CGMCCNO.12259在制备猪3型腺病毒疫苗中的应用。4.一种构建权利要求1所述的能增殖和包装缺失E1基因重组猪3型腺病毒的细胞系的方法,其特征在于，包括以下步骤：(1)构建表达HAV5E1的细胞系ST-E1；(2)构建表达PAV3E1Blarge和I-SceI的穿梭质粒；(3)构建稳定表达PAV3E1Blarge和I-SceI的细胞系ST-E1-E1Blarge-ISceI；(4)评价稳定表达IsceI/PAV3E1Blarge基因的ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞系。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，将含有HAV5E1基因的载体pTG4671转染ST细胞，用嘌呤霉素筛选，得到抗嘌呤霉素的ST-E1细胞系。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，以本...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志刚，陈瑞，董剑辉，
申请(专利权)人：北京康宝利华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11