一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法技术

本发明专利技术公布了一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法。首先设计蛋白质层层组装构筑单元，所述构筑单元为包含正交的蛋白质反应对以及功能蛋白结构域的融合蛋白，其中同一蛋白质反应对的两个蛋白质分别位于不同的构筑单元内；将构筑单元对应的基因引入表达载体中，并在细胞中表达；纯化表达的蛋白质，利用正交的蛋白质反应对对蛋白质进行层层组装，得到所需功能材料。本发明专利技术方法利用基因编码细胞表达的形式获得高纯度且稳定的活性蛋白质，所制备出的材料具有层间共价交联特性，适用于多种有机、无机材料界面，并可在修饰过程中以及修饰之后保持其中功能蛋白质的生物活性与响应性。

Preparation method of functional material for protein layer by layer assembly

The invention discloses a method for preparing functional materials for protein layer by layer assembly. The first design protein LbL assembly unit, the construction unit of fusion protein domains and functional protein reactions involving orthogonal, the same protein two protein on the reaction were located in different construction unit; unit will build the corresponding gene into the expression vector, and expressed in cells; purification the expression of protein of protein by protein self-assembly reaction orthogonal, to obtain the required functional materials. The method of the invention uses the form of expression of genes encoding cell active protein with high purity and stable, the prepared material has interlayer covalent crosslinking characteristics, suitable for a variety of organic and inorganic material interface, and can maintain the function of the biological activity of the protein after the modification process and modification and response.

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法
本专利技术涉及生物大分子的制备，特别涉及蛋白质及其功能组装材料的制备方法及其在表界面改性中的应用。
技术介绍
使用生物大分子进行表面/界面改性是十分重要的方向，因为这样可以有效地提高其生物相容性，甚至可以赋予其生物响应性和生物功能性。其中，蛋白质由于具有精确可控的结构与丰富多样的功能备受瞩目。层层组装技术是一种简单可靠的表/界面改性技术，它可以精确控制材料的组成与结构。近年来，这一技术已经在众多领域内得到了广泛的应用，包括高分子、无机粒子、金属等都可以进行有效的组装，并且赋予材料特殊的功能。但在生物方面，尤其是在蛋白质领域内，由于蛋白质复杂的结构，而且单位蛋白质上可以有效进行反应的位点较少，因此导致其很难有效地组装。同时，由于蛋白的折叠结构和功能对于化学修饰和环境都很敏感，如何确保组装后的蛋白质具有稳定的结构与功能仍然是一个重要的问题。目前，基于全蛋白质层层组装功能材料的报道极少，其中一个例子就是利用基因编码技术制备得到带有大量相反电荷的弹性蛋白类似物对(ELP)，然后利用其相互之间的静电相互作用进行层层组装，制备出了空心微胶囊(Kolbe,A.,etal.Macromol.Rapid.Commun.2011,32,186-90.)。截止到目前，尚未有报道提出制备出具有生物活性的和生物响应性的基于共价作用的全蛋白质层层组装材料。
技术实现思路
为了制备蛋白质层层组装薄膜以运用于材料的表界面修饰，本专利技术提供了一种利用重组蛋白质正交化学反应的方法。要实现蛋白质界面层层组装，需要满足以下几个条件：(1)需要建立在无机或者金属界面与蛋白质连接的桥梁。(2)在每一次交替组装过程结束后，材料表面应该仍然具有足够多的活性反应位点。对于第一个条件，许多特异性的化学反应如金与巯基间、硅烷偶联剂与硅材料之间，已经得到了广泛的应用，甚至已经发展出了一系列与无机材料相互作用的特定多肽序列等等。针对第二个问题，已经有人利用基因编码的工具设计并制备出来了具有多重相反电荷的类似弹性蛋白的聚多肽(ELP)，这种聚多肽可以在碳酸钙上层层组装制备核壳结构的生物胶囊。但是针对于材料如何保持生物活性的问题仍未解决。近年来，已经发展出来了一系列生物化学反应对，比如谍捕手(SpyCatcher)和谍标签(SpyTag)(Zakeri,B.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2012,109,E690-E697.)，探捕手(SnoopCatcher)和探标签(SnoopTag)(Veggiani,G.etal.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2016,113,1202-1207.)等等。这些反应对都来源于化脓性链球菌的蛋白质工具对，一般标签部分为只有十几个氨基酸的短肽，而捕手部分则是一段较长的蛋白质结构域。它们具有较好的生物相容性，并能在生理条件下发生高效的反应。除此之外，前期工作已经证明这两种反应对之间完全正交。如果能够合理地设计两种正交蛋白质反应对在融合蛋白中的位置与数量，那么将可以完美地实现在层层组装中活性位点的再生。本专利技术的研究发现，通过将这两种正交蛋白质反应对融合成新的构筑单元，可以有效地实现层层组装，同时还可以引入新的功能化结构域，赋予材料相应的功能。具体的，本专利技术的技术方案是：一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法，包括以下步骤：1)设计蛋白质层层组装构筑单元，所述构筑单元为包含正交的蛋白质反应对，以及功能蛋白结构域的融合蛋白，其中同一蛋白质反应对的两个蛋白质分别位于不同的构筑单元内；2)构建蛋白质层层组装构筑单元所对应的基因并引入表达载体中，然后在细胞中表达所构建基因对应的蛋白；3)对表达的蛋白质进行纯化，得到高纯度蛋白质层层组装构筑单元；4)利用正交的蛋白质反应对对蛋白质进行层层组装，得到所需功能材料。上述步骤1)中所述的正交的蛋白质反应对优先选用谍捕手和谍标签反应对，以及探捕手和探标签反应对。典型的谍标签(简称A)和谍捕手(简称B)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示，其对应的基因序列可以是序列表中SEQIDNo：3和SEQIDNo：4，也可以是基于密码子的简并性编码同样氨基酸序列的其它基因序列。典型的探标签(简称C)和探捕手(简称B)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示，其对应的基因序列可以是序列表中SEQIDNo：7和SEQIDNo：8，而基于密码子的简并性，也可以是其它编码同样氨基酸序列的基因序列。当然，其他的相互正交的蛋白质反应对亦可以应用在这里。除了正交蛋白质反应对以外，蛋白质构筑单元中还可以包括一个或者多个相同或不同的功能蛋白结构域，这些功能蛋白结构域位于正交蛋白质反应对之间。所述功能蛋白可以是弹性蛋白类似物(ELP)、纳米抗体(nanobody)、亲和体(Affibody)、超级铀结合蛋白(SUP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)等，以及医学、农业、工业、科研领域涉及的其他功能蛋白。下面通过一些具体例子来说明蛋白质层层组装构筑单元的结构：(a)探标签-谍捕手-探标签(CBC)：从N端到C端分别为探标签、谍捕手、探标签，其中每段探标签与谍捕手之间都插入一个弹性蛋白类似物(ELP)，其对应的基因序列可以是序列表中SEQIDNo：9，即CBC，其中第6-11位氨基酸残基为6×His，第16-28位氨基酸残基为探标签，第30-108位氨基酸残基为ELP，第123-249位氨基酸残基为谍捕手，第251-329位氨基酸残基为ELP，第344-356位氨基酸残基为探标签。(b)探捕手-谍标签-探捕手(DAD)：从N端到C端分别为探捕手、谍标签、探捕手，其中每段探捕手与谍标签之间都插入一个弹性蛋白类似物(ELP)，其对应的基因序列可以是序列表中SEQIDNo：10，即DAD，其中第6-11位氨基酸残基为6×His，第16-128位氨基酸残基为探捕手，第134-210位氨基酸残基为ELP，第213-225位氨基酸残基为谍标签，第227-305位氨基酸残基为ELP，第320-432位氨基酸残基为探捕手。除此之外，CBC还可以将其中第一个ELP结构置换成超级铀结合蛋白结构(SUP)或二氢叶酸还原酶(DHFR)，其对应的基因序列可以是序列表中SEQIDNo：11，SEQIDNo：12即CBC-SUP，CBC-DHFR。在SEQIDNo：11中，第6-11位氨基酸残基为6×His，第16-28位氨基酸残基为探标签，第31-110位氨基酸残基为SUP，第112-238位氨基酸残基为谍捕手，第252-318位氨基酸残基为ELP，第333-345位氨基酸残基为探标签。在SEQIDNo：12中，第6-11位氨基酸残基为6×His，第16-28位氨基酸残基为探标签，第31-189位氨基酸残基为DHFR，第192-318位氨基酸残基为谍捕手，第321-395位氨基酸残基为ELP，第413-425位氨基酸残基为探标签。上述步骤2)通过重组DNA技术构建蛋白质层层组装构筑单元所对应的基因，并引入到合适的载体质粒中。原核表达系统适用的载体例如pQE以及pET系列质粒。为后续的纯化方便，在蛋白质层层组装的构筑单元上N端加上6×H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法，包括以下步骤：1)设计蛋白质层层组装构筑单元，所述构筑单元为包含正交的蛋白质反应对以及功能蛋白结构域的融合蛋白，其中同一蛋白质反应对的两个蛋白质分别位于不同的构筑单元内；2)构建蛋白质层层组装构筑单元所对应的基因并引入表达载体中，然后在细胞中表达所构建基因对应的蛋白；3)对表达的蛋白质进行纯化，得到高纯度蛋白质层层组装构筑单元；4)利用正交的蛋白质反应对对蛋白质进行层层组装，得到所需功能材料。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质层层组装功能材料的制备方法，包括以下步骤：1)设计蛋白质层层组装构筑单元，所述构筑单元为包含正交的蛋白质反应对以及功能蛋白结构域的融合蛋白，其中同一蛋白质反应对的两个蛋白质分别位于不同的构筑单元内；2)构建蛋白质层层组装构筑单元所对应的基因并引入表达载体中，然后在细胞中表达所构建基因对应的蛋白；3)对表达的蛋白质进行纯化，得到高纯度蛋白质层层组装构筑单元；4)利用正交的蛋白质反应对对蛋白质进行层层组装，得到所需功能材料。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正交的蛋白质反应对为谍捕手和谍标签反应对，以及探捕手和探标签反应对，或者是其它彼此正交的蛋白质反应对。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述谍标签和谍捕手的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示，探标签和探捕手的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述谍标签和谍捕手对应的基因序列分别如序列表中SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示，所述探标签和探捕手对应的基因序列分别如序列表中SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示。5.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文彬，杨曙光，张雪健，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11