一种质粒载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有两个多克隆位点区，在两个多克隆位点区之间存在一个ccdB 表达框，可在多数大肠杆菌菌株中组成型表达毒性蛋白ccdB，作为负筛选标记。基于质粒载体的多克隆位点的设计，该质粒可用于进行定向TA克隆和改进的无背景粘性末端克隆。另外，本质粒载体还可以直接用于蛋白表达和纯化。各功能均得到验证。本发明专利技术所涉及的质粒载体因其更方便和高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。

Plasmid vector and construction method thereof

The present invention relates to the field of gene engineering, in particular, a plasmid vector with directional TA cloning, no background viscous terminal cloning and expression function and its construction method. The plasmid into double stranded closed circular DNA, containing two multiple cloning sites, between two multiple cloning sites have a ccdB expression box, expression of toxic protein ccdB in most Escherichia coli strains constitutively as negative selection marker. The design of the cloning site based on plasmid vector can be used for directional TA cloning and improved non background viscous terminal cloning. In addition, the plasmid can also be directly used for protein expression and purification. Each function has been verified. The plasmid vector involved in this study will play an important role in the field of gene engineering because of its convenience and efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种质粒载体及其构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。
技术介绍
分子克隆是研究基因结构和功能的基础，是分子生物学的核心技术。分子克隆方法可分为两类：依赖连接酶的克隆和不依赖连接酶的克隆。其中，依赖连接酶的克隆方法主要有三种，包括：平末端连接、粘性末端连接和TA克隆。近些年，各种不依赖连接酶的克隆策略也得到快速发展，比如：CPEC、FastCloning、Gateway、LIC、OEC、PIPE、SLIC、SLiCE、USER和重组酶克隆等技术（YaoS,HartDJ,AnY.RecentadvancesinuniversalTAcloningmethodsforuseinfunctionstudies.ProteinEngDesSel.2016;1-6.）。尽管不依赖连接酶的克隆方法有很多成功的应用实例，但是仍然不能完全取代依赖连接酶的克隆方法。作为一种依赖连接酶的克隆方法，粘性末端连接方法是目前应用最为广泛的分子克隆方法之一。但在某些情况下，由于无法获取合适的限制性酶切位点，因此为粘性末端克隆带来了不便。另外，由于产生粘性末端的酶切位点都具有回文结构，经酶切后的末端能与其自身互补，所以容易在后续的克隆步骤中产生两个质粒载体之间的连接和环化，从而产生假阳性。而TA克隆方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq聚合酶）的末端转移酶活性，在聚合酶链式反应（PCR）扩增插入片段的过程中在产物的3'端额外加入一个碱基“A”。而TA克隆所使用的T载体的3'端有一个凸出的碱基“T”，刚好可以与上述插入片段的3'末端的碱基“A”互补配对，通过连接可以实现TA克隆。TA克隆是目前克隆PCR产物最快捷、简便的方法之一。该方法无需选择合适的酶切位点，甚至可用于克隆序列未知的DNA片段。目前，T载体的制备方法常见的有两种。一种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用某些内切酶酶切能够产生3'端具有单个凸出的碱基“T”的线性T载体。另一种方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq酶）不依赖模板的末端转移酶活性，将单个脱氧胸腺核苷酸（dTTP）添加到线状载体3'端（MarchukD,DrummM,SaulinoA,CollinsFS.ConstructionofT-vectors,arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.NucleicAcidsRes.1991;19(5):1154.）。与第二种方法相比，第一种方法更稳定、快捷、高效。另外，第二种方法在制备T载体时，会出现加尾效率较低和加尾过程中线性质粒两端的序列有时会被部分删除等问题（ShumanS.NovelapproachtomolecularcloningandpolynucleotidesynthesisusingvacciniaDNAtopoisomerase.JBiolChem.1994Dec23;269(51):32678-32684.）。目前TA克隆主要存在的问题是克隆过程中片段可以随机的以正反两个方向插入到T载体中，这就造成了至少有一半的克隆外假阳性，从而增加了筛选的压力。尽管粘性末端克隆和TA克隆都有很多成功的例子，但是如何有效地解决粘性末端克隆过程中无法获取合适的限制性酶切位点，不利于克隆的顺利进行。另外，由于酶切位点具有回文结构，而导致的两个质粒载体之间的连接和环化，也是一个是亟待解决的问题。另外，实现定向TA克隆，减小后续筛选的工作量，也具有重要的意义，但是目前还没有任何质粒载体能够同时解决上述两个问题。既有克隆功能，又具有表达功能的载体具有显著的优势。但是目前很多载体只适用于克隆，而实现目的基因的表达与纯化则需要亚克隆到表达载体上。因此，既有克隆功能，又具有表达功能的载体具有显著的优势。现有的质粒载体虽然已经很多，但是普遍存在一些缺点，比如克隆效率不高，特别是过程中经常会出现假阳性，从而增加了后续筛选的压力。这些假阳性可能是由于载体的酶切不够彻底，或者是两个载体之间发生了收尾相连并形成环化。而TA克隆作为一种简易的克隆方法，则存在克隆过程无法定向的问题（即只有一半的克隆的插入片段与载体的连接方式与预期相符）。另外，常用的T载体不能兼具克隆和表达功能。综上所述，一种不依赖限制性酶切位点、可避免质粒载体之间的连接和环化、同时能够用于实现定向TA克隆，并具有表达和纯化功能的载体具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有广泛的应用前景、兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种可用于定向TA克隆和无背景粘性末端克隆，并具有表达功能的质粒载体，载体包括启动子和终止子，载体为闭合环状双链DNA，含有两个克隆位点区，每个克隆位点区含有一个AhdI位点和一个BsaI位点。两个AhdI位点分别能产生凸出“T”末端并引入AvrII和NcoI识别位点一半序列；而这两个BsaI位点经过酶切后可引入两个互补对称的粘性末端，其3’凸出碱基序列不互补，而且每个粘性末端的3’凸出碱基序列不会自身回文互补，可有效避免粘性末端克隆过程中载体片段的首尾相连，从而实现完全无背景的粘性末端克隆。在两个克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB基因。所述载体还包括卡纳霉素抗性基因序列、pMB1复制子和C末端His-tag编码序列。所述启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。所述载体为SEQIDNo:1中所示的碱基序列；载体中所示的DNA功能区：特殊设计的克隆位点区的AhdI位点用于制备T载体，进行TA克隆；BsaI位点用于制备末端随机的粘性末端载体，进行粘性末端克隆；T7promoter和T7terminator使该质粒具有蛋白表达功能；C末端His-tag区使得表达后的蛋白能被镍柱纯化；ccdB基因序列编码毒性蛋白，作为克隆过程的负筛选标记，确保克隆没有假阳性。一种可用于定向TA克隆和无背景粘性末端克隆，并具有表达功能的质粒载体的构建方法：1）以质粒pET3a为模板，PHis-for1和PHis-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1，待用；PHis-for1：5’-AAAACTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTG-3’和PHis-rev1：5’-GTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’；2）以质粒pET9a为模板，PET9-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2，待用；PET9-for1:5’-GAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTAC-3’和PET9-rev1:5’-CAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTT-3’；3）以上述片段1和片段2混合物为模板，PHis-for1和PET本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒载体，其特征在于：质粒载体为闭合环状双链DNA，含有两个BsaI酶切位点（5’‑GGTCTCN↓NNNNN‑3’）、粘性末端；含有两个特定序列的AhdI酶切位点、一半的AvrII和NcoI识别位点序列，克隆位点之间含有一个ccdB 表达框。

【技术特征摘要】
1.一种质粒载体，其特征在于：质粒载体为闭合环状双链DNA，含有两个BsaI酶切位点（5’-GGTCTCN↓NNNNN-3’）、粘性末端；含有两个特定序列的AhdI酶切位点、一半的AvrII和NcoI识别位点序列，克隆位点之间含有一个ccdB表达框。2.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体还包括卡那霉素抗性基因序列、pMB1复制子和C末端His-tag编码序列。3.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。4.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述两个克隆位点区各含有一个AhdI位点，通过AhdI酶切可在载体片段两端各引入一个3’凸出单个“T”碱基，形成T载体。5.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述两个克隆位点区各含有一个BsaI位点，通过BsaI酶切可引入两个粘性末端，其3’凸出碱基序列不互补，而且每个粘性末端的3’凸出碱基序列自身无法回文互补。6.按权利要求1-5任意一项所述的质粒载体，其特征在于：所述载体为SEQIDNo:1中所示的碱基序列。7.一种权利要求1所述的质粒载体的构建方法，其特征在于：1）以质粒pET3a为模板，PHis-for1和PHis-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1，待用；PHis-for1：5’-AAAACTGCAGCACCACCACCACCACCACTAAGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTG-3’和PHis-rev1：5’-GTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’；2）以质粒pET9a为模板，PET9-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2，待用；PET9-for1:5’-GAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTAC-3’和PET9-rev1:5’-CAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTT-3’；3）以上述片段1和片段2混合物为模板，PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2，待用；4）以质粒pET3a为模板，PT7-for2和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：安迎锋，高和瑞，高嵩，张艺锋，许淑敏，刘霞，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21