在细胞培养物中生产重组高分子量 vWF 的方法技术

除了其它方面以外，本发明专利技术涉及用于生产高分子量vWF(具体地，具有高比活性的高度多聚的WF和具有高比活性的ADAMTS13)的细胞培养条件。本发明专利技术的细胞培养条件可以包括，例如，具有增加的铜浓度的细胞培养基和/或具有低铵(NH4

Method for producing recombinant high molecular weight vWF in cell culture

In addition to other aspects, the present invention relates to cell culture conditions for the production of high molecular weight vWF (specifically, highly active WF with high specific activity and ADAMTS13 with high specific activity). The cell culture conditions of the present invention may include, for example, a cell culture medium with an increased copper concentration and / or with low ammonium (NH4)

【技术实现步骤摘要】
在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法本申请是申请日为2011年07月08日、申请号为201180043100.7(国际申请号为PCT/US2011/043455)、名称为“在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2010年7月8日提交的美国临时专利申请系列号61/362,635的优先权，其公开内容特此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
技术介绍
治疗性蛋白在细胞培养物(特别是大规模细胞培养物，包括真核细胞培养物和更具体的哺乳动物细胞培养物)中的重组表达，需要使用特殊培养基，所述特殊培养基为细胞的有效生长提供营养物质。经常给细胞培养基制剂补充多种添加剂，包括胎牛血清(FCS)、动物衍生的蛋白和/或牛源蛋白水解物以及从植物或酵母衍生出的蛋白水解物。使用这种培养物的一项挑战是，甚至当细胞培养基的制剂没有变化时，在不同的细胞培养物之间，蛋白的量和生产的蛋白的总活性和比活性经常会变化。在使用10升至超过20,000升的细胞培养体积的大规模生产工艺的情况下，该变化性是特别明显的。含有水解物的细胞培养基特别易于随细胞培养物不同而变化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含重组Von Willebrand因子(rVWF)的细胞培养物上清液，其中至少20％的rVWF是以超过10个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在，所述细胞培养物上清液经补充以提供2.4μg/L至20μg/L之间的最终铜浓度，所述细胞培养物上清液中的NH4

【技术特征摘要】
2010.07.08 US 61/362,6351.一种包含重组VonWillebrand因子(rVWF)的细胞培养物上清液，其中至少20％的rVWF是以超过10个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在，所述细胞培养物上清液经补充以提供2.4μg/L至20μg/L之间的最终铜浓度，所述细胞培养物上清液中的NH4+含量维持在低于4mM的浓度，并且在细胞培养期间细胞密度维持在小于2.5×106个细胞/mL。2.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液每mL含有至少0.5IU利托菌素辅因子活性。3.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/μgrVWF。4.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少40mU/μgrVWF。5.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少50mU/μgrVWF。6.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少60mU/μgrVWF。7.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少70mU/μgrVWF。8.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少80mU/μgrVWF。9.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液中至少30％的rVWF是以超过10个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在。10.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述rVWF是以14至22个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在。11.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液进一步包含重组因子VIII(rFVIII)。12.根据权利要求11所述的细胞培养物上清液，其中rVWF与rFVIII之比是至少10:1。13.一种用于生产重组VonWillebrand因子(rVWF)蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供基础细胞培养基；(b)给所述基础细胞培养基补充铜，以提供2.4μg/L至20μg/L之间的最终铜浓度；(c)提供一个或多个细胞，所述一个或多个细胞包含编码rVWF蛋白的核酸；(d)在补充了铜的细胞培养基中连续培养所述一个或多个细胞，使得细胞表达rVWF并将其分泌进培养物上清液中，所述细胞培养物上清液中NH4+含量维持在低于4mM的浓度，所述NH4+含量在所述一个或多个细胞的连续培养中维持至少7天，并且在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中将细胞密度维持在小于2.5×106个细胞/mL；和(e)回收所述培养物上清液的至少一部分，其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/μgrVWF。14.根据权利要求13所述的方法，其另外包括下述步骤：在培养所述一个或多个细胞之前，用水解物补充所述基础细胞培养基。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水解物是植物水解物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述水解物是大豆水解物。17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含动物蛋白的培养基。18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含蛋白的培养基。19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是化学成分确定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·格里尔贝格尔，M·赖特尔，W·蒙特，
申请(专利权)人：百深有限责任公司，百深公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH