一种vWF活性保护液制造技术

本发明专利技术公开了一种vWF活性保护液，用于从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备中，在血管性血友病因子的制备工艺中，对层析缓冲液加入甘氨酸，层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白，保护vWF活性。本发明专利技术层析缓冲液中加入甘氨酸可以在层析分离纯化过程中，减少vWF的活性损失。在蛋白透析液中加入白蛋白、赖氨酸、甘氨酸作为冻干保护剂，可稳定vWF分子。白蛋白是优良蛋白稳定剂，同时可以有效蛋白质表面的吸附。赖氨酸、甘氨酸为小分子氨基酸，可以保护蛋白质结构，能升高成品的塌陷温度，阻止冻干过程中因塌陷导致的蛋白质损伤。保持生物学活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从人血浆冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺，特别涉及一种vWF活性保护液，属于生物制药领域。
技术介绍
vWF是一种具有多聚体的血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2千万kDa不等，形成血浆中已知的最大分子量可溶性蛋白。血浆中小分子量vWF主要是二聚体形式，分子量约500kDa。大小不等的多聚体，对维持vWF正常生物活性具有重要意义。血浆vWF在原发性止血中起着重要作用，其负责血小板与受损伤血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白交联的形成。另外，血浆vWF起着凝血因子VIII的运输剂和稳定剂的作用。血管性血友病(vWD)是最常见的遗传性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(vonWillebrandfactor，vWF)基因突变或调控异常导致血浆vWF数量减少或质量异常。vWD临床特征主要为皮肤黏膜出血，2N型和3型患者还可发生与血友病A相似的关节腔出血和肌肉血肿。据国外报道，vWD发病率(2.3～11.0)/10万人口，一般认为在遗传性出血性疾病中，vWD居第二位。临床上vWF的活性用瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:RCo)来表征，主要用于治疗先天性、获得性血管性血友病(vWD)，一般以20～60UvWF:RCo/kg剂量来给药。研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子类物质。在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备vWF，对冷沉淀的综合利用，节约稀缺血浆资源，提高市场竞争力具有重大意义。现有技术中，较早的工艺使用vWF的抗体偶联到琼脂糖凝胶上，通过免疫亲和层析纯化vWF，但其抗体制备周期长，凝胶载量低，不适合作大规模制备，如《PurificationofvonWillebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》(UP4774323)。有专利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)纯化vWF因子组分，纯度高，但是工艺比较复杂，需要两步离子交换和一步亲和层析，如《Processforanindustrial-scalepreparationofastandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefortherapeuticuse》(US5408039)。也有报道CHT层析结合PH5.4酸沉淀分离vWF组分的，其比活不高，且酸沉淀去除纤维结合蛋白的同时，可能影响vWF的生物学活性，如《Productionofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity》(US20070135619A1)。另外还有一些工艺用EMDFractogelTMAE(Merck)来纯化VIII/vWF因子复合物，但是都无法单独得到高纯度的vWF，治疗针对性不强，如《具有止血活性的含有vWF的制剂及其制备方法》(CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactorVIIIbyanionexchangerchromatography》(US5714590)。还有一些公司用基因重组的方法(猴肾细胞或CHO细胞)纯化vWF，他们通过阴离子交换层析法从动物细胞培养液中进行提纯，但是由于动物原性抗原的存在，人体对其可能有排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactor》(US5854403)。另有采用两步层析法纯化制备vWF的报道，但其纯度不高，比活相对较低，仅50IU/mg，如《ProcessformanufacturingvonWillebrandfactor》(US5252710)。可见，现有的的vWF纯化工艺仍存在一些问题：(1)制备周期长，不适应于大规模制备，尤其是采用免疫亲和层析法纯化时，其抗体制备周期长，凝胶载量低。(2)VIII/vWF复合物产品在较难控制工艺稳定性；(3)重组方法所得vWF产品可能存在异质抗原；(4)分离纯化工艺繁琐。目前，血管性血友病可用冷沉淀、VIII/vWF因子复合物和DDAVP(1-去氨基-8-D-精氨酸加压素)治疗，但针对性不强，更纯的vWF因子可专一性治疗各种类型的血管性血友病，与前几种方法比有较大优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种vWF活性保护液。本专利技术的主要技术构思如下：本专利技术对经层析后的蛋白液在层析缓冲液中加入甘氨酸保护vWF活性；优选层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白作为冻干保护剂，保护vWF活性；优选层析缓冲液中甘氨酸质量浓度0.6％～1％，冻干保护剂中赖氨酸质量浓度2～3％，甘氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量浓度0.8～1.3％。所述保护液分为洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液B和透析液，用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化时，用洗涤缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱；在明胶亲和层析进行纯化时，用洗脱缓冲液B洗涤柱子直至成基线，收集上样后经层析柱流出来的液体，用透析液透析。洗涤缓冲液B的配方：4g枸橼酸钠，11.4g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为5.8～6.8。洗脱缓冲液B配方：4g枸橼酸钠，16.38g氯化钠，3g氯化钙，6g甘氨酸，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为5.8～6.8。透析液的配方：2.94g枸橼酸钠，25g氯化钠，0.111g氯化钙，30g甘氨酸，2g盐酸赖氨酸，人血白蛋白8g，加适量注射用水充分溶解，补加注射用水至1L，调节PH为6.8～7.2。从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备工艺，它依次包括：冷沉淀溶解、2％氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析；离子交换层析得收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产，再从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料即收集经层析柱流穿出的液体中提取vWF；Q-Sepharose阴离子交换层析、明胶亲和层析、除菌过滤分装、冷冻干燥、干热灭活。离子交换层析流穿液收集后，先浓缩一倍，再用洗涤缓冲液B等体积超滤6次，再经Q-Sepharose层析柱，用洗脱缓冲液B收集洗脱下来的蛋白液。从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种vWF活性保护液，用于从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子的制备中，其特征在于，在血管性血友病因子的制备工艺中，对层析缓冲液加入甘氨酸，层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白，保护vWF活性。

【技术特征摘要】
1.一种vWF活性保护液，用于从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中提取血管性血友病因子
的制备中，其特征在于，在血管性血友病因子的制备工艺中，对层析缓冲液加入甘氨酸，层
析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白，保护vWF活性。
2.根据权利要求1所述的一种vWF活性保护液，其特征在于，层析缓冲液中甘氨酸质量
浓度0.6％～1％，冻干保护剂中赖氨酸质量浓度2～3％，甘氨酸质量浓度0.2％，白蛋白质量
浓度0.8～1.3％。
3.根据权利要求1所述的一种vWF活性保护液，其特征在于，所述保护液分为洗涤缓冲
液B、洗脱缓冲液B和透析液，用Q-Sepharose阴离子交换层析柱进行层析纯化时，用洗涤
缓冲液B洗涤柱子直至成基线，用洗脱缓冲液B洗脱；在明胶亲和层析进行纯化时，用洗脱
缓冲液B洗涤柱子直至成基线，收集上样后经层析柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨笃才，梁小明，何淑琴，杨智，刘宇良，匡青芬，
申请(专利权)人：江西博雅生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36