人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒包括A液、B液、C液和质控标准品，所述A液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10；所述B液为0.1～10mM含有人羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物的溶液；所述C液为荧光素检测试剂；所述质控标准品为5mg/ml的hCE1的pH 6.5的磷酸盐溶液。该探针底物为(S)‑2‑(2‑(6‑二甲氨基)‑苯并噻唑)‑4,5‑二氢噻唑‑4‑甲酸甲酯,可被hCE1特异性催化发生酯键水解反应，通过定量检测单位时间内其酯键水解产物的生成量来测定各类生物样品中hCE1酶的活性。该试剂盒可用于检测不同生物样本中hCE1的存在与否及其酶活性的定量测定，可用于快速筛选hCE1的抑制剂/诱导剂。本发明专利技术优点为操作简单、单位检测成本低、灵敏、快速、可高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用
本专利技术属医药生物
，具体涉及一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。
技术介绍
人羧酸酯酶1(hCE1)是人体内分布的一种重要功能蛋白，其在人群的肝脏中含量很高，其蛋白表达量在肝脏分布蛋白中排前十位。hCE1是一种膜结合蛋白，定位于细胞内质网中【CANCERRESEARCH1998；58:3627-32&DrugMetab.Pharmacokinet.2006；21:173-85】，同时也会分泌到细胞外进入血液循环系统【Proteomics2009；9:3989–99】。hCE1的基本代谢反应是催化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解。虽然，在多种组织的中都检测到hCE1的蛋白表达，但其在人肝脏组织含量远高于其它组织。hCE1参与多种外源性物质的代谢清除，例如药物奥司他韦、哌醋甲酯等。同时，hCE1在维持人体正常生理功能功能发挥不可忽视的作用，参与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程，维持脂质代谢平衡【Chemistry&Biology,Vol.10,341–349,April,2003】。在正常健康人体中，hCE1除了以较高的含量分布在肝组织的细胞中，也有少量hCE1在血浆中被检测到，更重要的是，肝细胞肝癌患者血浆中的hCE1是健康人群的2-5倍，因此hCE1被认为是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的潜在血清学标志物【Proteomics2009,9,3989–3999】。此外，肝细胞破损相关的肝脏疾病患者也会有hCE1释放入血，引起血浆中hCE1浓度发生变化，因此，血浆中hCE1可作为肝脏急性损伤的标志物。hCE1的分布存在很大的个体差异，hCE1酶的表达和功能本身会受到人体遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，hCE1酶的活性检测方法具有广阔的临床应用前景，可用于评价人体肝脏功能异常、药物及毒物导致的肝毒性、肝细胞癌早期诊断、肝功能个体化评估、以及部分前体药物的个性化使用等。此外，hCE1作为维持人体脂质代谢平衡的重要蛋白，其抑制剂可作为降血脂药物使用，hCE1也被FDA批准为重要的药物作用靶点。hCE1活性的快速表征方法也可用于新药研发早期发现及评估hCE1新型高效抑制剂。因此，开发高效、超灵敏、高特异性的hCE1活性检测方法对于临床样本中hCE1活性的检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶法检测人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒使用(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸甲酯作为人羧酸酯酶1探针底物，探针经hCE1水解后可生成萤火虫荧光素酶的底物(图1)。基于单位时间产物的生成量来表示酶的活性。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速高效等特点。一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，该试剂盒包括4种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；所述A液为：为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10，所述B液为0.1～10mM的含有人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜，所述C液为荧光素酶检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg2+及50g/ml的荧光素酶,所述质控标准品为5mg/ml的hCE1水溶液。保存方式：保存在－20℃冰箱里，所述A液、所述B液、所述C液避免光照；有效保证6月。一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂的使用方法，具体按下面步骤进行：(1)预孵育：将待测样品与A液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；混合液总体积为20μL，将待测样品的浓度为：(0～0.5mg/ml)；(2)起始反应：加入B液后混匀，20～60度下孵育2～120分钟；B液的体积为30μL，终浓度10μM；(3)检测：加入C液，混匀，37℃孵育20-30min，用酶标仪或化学发光分析仪测定样品，所述C液加入量为50μL。所述待测样品重组表达的hCE1、含有hCE1的哺乳动物细胞/组织制备液、血浆或其他常见生物样本。一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的应用，该试剂盒可用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测，以及该酶抑制剂的快速筛选与评估。所述试剂盒用于人羧酸酯酶1活性的快速定量检测的方法为：探针底物(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸甲酯可被人羧酸酯酶1特异性水解为萤火虫荧光素酶的底物；按照试剂盒的使用方法，通过定量检测单位时间内样品中的(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸与荧光素酶反应所产生的生物发光强度来表征水解产物的生成量，进而测定不同样本中人羧酸酯酶1的活性。该试剂盒用于人羧酸酯酶1抑制剂的快速筛选与评估方法为：以人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物的水解反应作为hCE1的特异性探针反应，按照试剂盒的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCE1的残余活性，进而实现hCE1抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。该试剂盒检测原理是利用人羧酸酯酶1能催化水解酯键的特性，特异地识别与催化人羧酸酯酶1的特异性生物探针底物结构中的甲酯，在生理pH条件下水解生成萤火虫荧光素酶的底物。利用该探针反应可对多种生物体系中hCE1的分布和功能进行定量评价。本专利技术所述特异性检测人羧酸酯酶(hCE1)的试剂盒的应用领域，包括但不限于重组表达的hCE1酶、含有hCE1的细胞及组织制备物、血浆等生物样品中hCE1活性的定量测定。本专利技术提供的检测人羧酸酯酶1(hCE1)的试剂盒的应用，需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。本专利技术所提供的检测人羧酸酯酶1(hCE1)的试剂盒，产物(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸是萤火虫荧光素酶的底物，可采用化学发光检测器实现产物的快速灵敏检测。此外，该特异性探针底物及相应hCE1活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE1酶活的定量测定。本专利技术中试剂盒可用于重组羧酸酯酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中hCE1酶活的定量测定，还可用于快速筛选hCE1酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。选用本专利技术所述的人羧酸酯酶1检测试剂盒及其使用方法具有以下突出优势：(1)高特异性：(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸甲酯可被hCE1高特异性地代谢成一个代谢产物，即甲酯键断裂的水解产物；(2)廉价易得：底物简称(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸甲酯及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；(3)高灵敏度：水解产物为荧光素酶的底物，可用荧光素酶检测试剂进行高灵敏度的检测，最低定量下限为0.1nM。(4)高通量检测：利用该类荧光探针底物可实现96,384孔板的快速检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。附图说明图1.人羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物检测示意图；图2.人重组单酶筛选试验；图3.hCE1水解特异性生物发光底物的线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下四种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；其中所述A液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10，B液为0.1～10mM含有人羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；C液为荧光素检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg

【技术特征摘要】
1.一种人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如下四种试剂：A液、B液、C液和质控标准品；其中所述A液为100mM磷酸盐缓冲液，pH＝5.5～10，B液为0.1～10mM含有人羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物的溶液，溶剂为二甲基亚砜；C液为荧光素检测试剂，含0.5mM的ATP，10mM的Mg2+及50g/ml的荧光素酶；质控标准品为5mg/ml的hCE1的pH6.5的磷酸盐溶液；所述人羧酸酯酶1(hCE1)的特异性生物发光探针底物为(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸甲酯，可被hCE1特异性催化发生酯键水解反应并生成相应的羧酸产物(S)-2-(2-(6-二甲氨基)-苯并噻唑)-4,5-二氢噻唑-4-甲酸，该探针底物和水解产物的结构如下：2.按照权利要求1所述的人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒，其特征在于A液优选pH＝6.5的缓冲体系。3.一种如权利要求1所述人羧酸酯酶1的生物发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于按照如下步骤进行检测：(1)预孵育：将待测样品与A液混匀，20～60度下孵育3～5分钟；混合液总体积为20μL，将待测样品的浓度为0～0.5mg/ml；(2)起始反应：加入B液后混匀，20...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，王丹丹，葛广波，邹立伟，王平，于洋，杜逊甫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21