基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法技术

本发明专利技术公开一种基于壳聚糖‑铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是利用酸性磷酸酶水解抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，影响壳聚糖‑铂模拟氧化酶/3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺盐酸盐催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于酸性磷酸酶及其抑制剂含量的测定。在0.25~2.5 U/L范围内，吸光度变化值△A450与酸性磷酸酶浓度呈线性关系，检测限为0.0161 U/L。本发明专利技术操作简便、灵敏度高，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中酸性磷酸酶及其抑制剂含量的测定。

Method for determination of acid phosphatase of chitosan platinum oxidase based on Simulation

The invention discloses a method for the determination of acid phosphatase of chitosan simulation based on platinum oxidase, which is characterized by acid phosphatase hydrolysis l-ascorby1-2-phosphate generated ascorbic acid oxidase /3 simulation, chitosan platinum 3 ', 5', 5 four methyl benzidine hydrochloride salt catalytic color reaction system, combined with changes in spectral features the color of the solution and UV absorption, applied to the direct determination of acid phosphatase inhibitor and its content. In the 0.25~2.5 range of U/L, the change of the absorbency of A450 showed a linear relationship with the concentration of acid phosphatase, the detection limit is 0.0161 U/L. The invention has simple operation and high sensitivity, and can be used as an analytical method for the determination of acid phosphatase and its inhibitor content in the environment and life science system.

【技术实现步骤摘要】
基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法
本专利技术涉及壳聚糖-铂模拟氧化酶催化显色体系的酸性磷酸酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学和纳米

技术介绍
酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的一种水解酶，广泛分布在一些植物或是哺乳动物的组织中。农业方面，酸性磷酸酶对判断农作物生长的最适pH有重要作用。医学方面，其可作为肝炎、甲状旁腺功能亢进、红血球病变等疾病的重要诊断指标。因此，酸性磷酸酶含量的测定有着深远意义。但目前酸性磷酸酶的测定还存在诸多局限，例如，现有方法主要选用4-硝基苯磷酸二钠作为底物，然而水解反应产生的硝基苯需要在碱性条件下才有比较强的信号，这与酸性磷酸酶的最适催化条件（pH=5.0）相矛盾。故发展一种更有效、准确的比色方法来测定酸性磷酸酶具有非常重要的实际意义。酸性磷酸酶在温度为37℃，pH为5.0的条件下可以水解抗坏血酸磷酸酯，生成抗坏血酸。而具有强还原型的抗坏血酸可以抑制氧化酶对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的催化氧化作用，使得3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色不明显。酸性磷酸酶的含量越高，体系的吸收度值越小。基于此，可实现对酸性磷酸酶进行定量测定。本专利技术以抗坏血酸磷酸酯为酸性磷酸酶底物，以壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系为检测信号源，建立了一种比色测定酸性磷酸酶的方法。酸性磷酸酶催化水解反应和壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色反应可在同一pH下进行。该方法简便、快捷，不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系，以抗坏血酸磷酸酯为底物，从而测定酸性磷酸酶及其抑制剂的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反应产物中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于酸性磷酸酶含量的测定；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50mL浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2mL浓度为10mmol/L氯铂酸加入到47mL浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶，所得产物避光冷藏保存。所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是将50μL浓度为4mmol/L的抗坏血酸磷酸酯和50μL不同浓度的酸性磷酸酶加入到200μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，然后依次加入632.5μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液、50μL浓度为3mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μL壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A450。所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在在0.25~2.5U/L范围内，吸光度变化值△A450与酸性磷酸酶浓度呈线性关系，检测限为0.0161U/L。本专利技术所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的测定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是包括如下步骤：将50μL浓度为4mmol/L的抗坏血酸磷酸酯和50μL人血清加入到200μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，依次将632.5μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液、50μL浓度为3mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μL壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液加入到上述反应液中，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A450，根据酸性磷酸酶标准曲线计算人血清中的碱性磷酸酶含量；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50mL浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2mL浓度为10mmol/L氯铂酸加入到47mL浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶。所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的测定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是得人血清样品测定的回收率为97.4%~107.8%，相对标准偏差为2.4~6.4%。本专利技术所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶抑制剂的测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯、酸性磷酸酶和酸性磷酸酶抑制剂的反应产物中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于碱性磷酸酶抑制剂抑制率的测定；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50mL浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2mL浓度为10mmol/L氯铂酸加入到47mL浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶。所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶抑制剂的测定方法，其特征是将50μL浓度为4mmol/L的抗坏血酸磷酸酯和50μL浓度为0.1U/mL的酸性磷酸酶溶液加入到200μL含不同浓度氟化钠的pH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，依次加入632.5μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液、50μL浓度为3mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μL壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A450，计算抑制率，通过软件拟合得到氟化钠的IC50为0.896mmoL/L。具体地说，本专利技术采用如下技术方案：（一）壳聚糖-铂模拟氧化酶的制备：称取0.1g壳聚糖溶解于50mL浓度为1%（v/v）的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2%（m/v）的壳聚糖溶液。将2mL浓度为10mmol/L氯铂酸加入到47mL浓度为0.2%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液（5分钟之内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于壳聚糖‑铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反应产物中加入3，3’，5，5’‑四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖‑铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于酸性磷酸酶含量的测定；所使用的壳聚糖‑铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1 g壳聚糖溶解于50 mL浓度为1 v/v %的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2 m/v %的壳聚糖溶液，将2 mL浓度为10 mmol/L氯铂酸加入到47 mL浓度为0.2 m/v %壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1 mL浓度为0.2 mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖‑铂模拟氧化酶，所得产物避光冷藏保存。

【技术特征摘要】
1.一种基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反应产物中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于酸性磷酸酶含量的测定；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50mL浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2mL浓度为10mmol/L氯铂酸加入到47mL浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1mL浓度为0.2mol/L新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶，所得产物避光冷藏保存。2.根据权利要求1所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是将50μL浓度为4mmol/L的抗坏血酸磷酸酯和50μL不同浓度的酸性磷酸酶加入到200μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，然后依次加入632.5μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液、50μL浓度为3mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μL壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A450。3.根据权利要求1或2所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在在0.25~2.5U/L范围内，吸光度变化值△A450与酸性磷酸酶浓度呈线性关系，检测限为0.0161U/L。4.一种基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的测定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是包括如下步骤：将50μL浓度为4mmol/L的抗坏血酸磷酸酯和50μL人血清加入到200μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，依次将632.5μLpH为5，浓度为50mmol/L的醋酸盐缓冲液、50μL浓度为3mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μL壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液加入到上述反应液中，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μL浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值A450，根据酸性磷酸酶标准...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，邓豪华，林秀玲，彭花萍，李柯林，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建,35