The present invention relates to the expression method of recombinant protein of Agkistrodon acutus thrombin. The method comprises the following steps: (1) the optimization of thrombin gene from Agkistrodon acutus acutus thrombin (2) gene was amplified by PCR after optimization; (3) to construct Agkis pMCX expression vector, will feel the amplified plasmid was transformed into E.coli competent cells, the positive clones were screened by Amp resistance, sequencing, sequencing, extraction the recombinant plasmid; (4) the recombinant plasmid was transfected into CHO cells; (5) the expression of recombinant protein identification. The invention is used for the first time in serum-free suspension culture of CHO cells expressing a recombinant thrombin acutus, by means of biological engineering, has successfully solved the problem of product quality, lack of sources of raw materials of snake venom unstable production.
【技术实现步骤摘要】
一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法
本专利技术涉及一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法。
技术介绍
尖吻蝮蛇凝血酶(HaemocoagulaseAcutus,简写为Halase)是本团队研发的一类止血新药,是一种从尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒中分离纯化的类凝血酶,具有较强的止血作用,且安全无毒。目前,毒蛇的来源主要为人工饲养和野外捕捉两种方式,各异的地理环境和饲养条件等因素,使得蛇毒的成分和性质都存在着很大的差异,为规模化生产造成一定的难度,产品的均一性受到限制。随着生物工程技术的发展,开发蛇毒类凝血酶(SnakeVenomThrombin-LikeEnzymes,SVTLEs)重组蛋白产品替代这类天然产物成为了SVTLEs药物研发的一个重要方向,以期通过蛋白质工程的手段,稳定表达具有良好生理活性的SVTLEs产品。对于SVTLEs重组蛋白表达体系的构建,最早是通过原核表达系统进行的。虽然SVTLEs的糖基化修饰情况不尽相同,但是大部分SVTLEs都是糖蛋白,含量在0%-30%间,个别种类甚至高达40%以上。而常用的细菌表达株并不具备糖基化的能力,这将大大影响到蛋白的活性。而且大肠杆菌的表达多以包涵体形式存在,研究人员通常需要添加硫氧还原蛋白(thioredoxin,TrxR)标签来增加外源蛋白的可溶性表达。真核表达系统中,较为成熟的酵母表达体系也被用作SVTLEs的重组蛋白表达。然而酵母表达体系对于外源蛋白的表达可能存在过度的糖基化修饰,或者缺乏复杂性糖链的修饰,这些也会影响重组蛋白的功能。哺乳动物细胞表达体系因具有更高级的糖基化 ...
【技术保护点】
一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法,依次包括尖吻蝮蛇凝血酶基因优化、优化基因PCR扩增、表达载体构建、重组质粒转染及重组蛋白表达鉴定步骤,其特征在于:所述的表达载体构建方法为将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接,构建Agkis‑pMCX质粒,将Agkis‑pMCX质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增,经Amp抗性筛选出阳性克隆,进行测序;提取测序正确的重组质粒;所述的重组质粒转染方法为将重组质粒转染至CHO细胞,其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染,含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。
【技术特征摘要】
1.一种尖吻蝮蛇凝血酶重组蛋白的表达方法,依次包括尖吻蝮蛇凝血酶基因优化、优化基因PCR扩增、表达载体构建、重组质粒转染及重组蛋白表达鉴定步骤,其特征在于:所述的表达载体构建方法为将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接,构建Agkis-pMCX质粒,将Agkis-pMCX质粒转化大肠杆菌感受态细胞中扩增,经Amp抗性筛选出阳性克隆,进行测序;提取测序正确的重组质粒;所述的重组质粒转染方法为将重组质粒转染至CHO细胞,其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染,含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。2.如权利要求1所述的表达方法,其特征在于:所述的重组质粒转染方法具体为:取细胞适量离心,用新鲜溶液重悬,使细胞终密度为5mioc/mL;离心时,将质粒DNA与PEI预混,室温孵育3-5min;处理好的DNA&PEI混合物,加到准备的细胞中,混匀,31℃培养;转染后10min,加入适量的DMSO,摇晃混匀,31℃培养;转染后取样品进行检测;其中包含蛋白质基因全长的重组质粒单独转染,含A亚基基因序列和B亚基基因序列的重组质粒共转染至CHO细胞。3.如权利要求1或2所述的表达方法,其特征在于:所述的表达载体构建方法中将回收的PCR产物与pMCX克隆载体酶切连接的具体方法为:对PCR产物...
【专利技术属性】
技术研发人员:邓沁,沈潇,苏薇薇,吴忠,彭维,王永刚,
申请(专利权)人:中山大学,
类型:发明
国别省市:广东,44
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