玉米转录因子ZmbHLH167及其应用制造技术

本发明专利技术涉及玉米转录因子ZmbHLH167及其应用。该基因为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。该序列编码的蛋白ZmbHLH167通过利用CRISPR‑Cas9技术将

Maize transcription factor ZmbHLH167 and its application

The present invention relates to maize transcription factor ZmbHLH167 and its application. The gene sequence for SEQ ID NO:1 shown. The sequence encoding the ZmbHLH167 protein by using CRISPR Cas9 technology to

【技术实现步骤摘要】
玉米转录因子ZmbHLH167及其应用
本专利技术涉及一种玉米转录因子ZmbHLH167及其应用。技术背景玉米（Zeamays）是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是重要的禽畜饲料以及重要的工业原料。随着世界人口的不断增加，提高玉米的产量和品质对于人类来说具有重要的意义。玉米胚乳是玉米籽粒主要的营养储存场所，胚乳中含有大量的淀粉（占胚乳干重约80%）和蛋白（占胚乳干重约10%），玉米的胚中含有大量的油脂。研究者通过对一系列玉米籽粒突变体的研究，希望能够提高玉米的产量和品质。例如，opaque2突变体使得人类必需氨基酸赖氨酸含量增加接近2倍。研究表明，此突变体蛋白品质的改善得益于非醇溶蛋白和醇溶蛋白比例的增加。因此，玉米籽粒突变体的产生对于研究和改造玉米具有极其重要的研究意义。CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES细胞打靶和TALEN等技术后第四种基因敲除的新技术，此种基因敲除的方法具有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，被广泛应用于敲除各个物种并且效率很高。其作用机制是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。之前的研究报道，在模式植物拟南芥中有一个名为ZHOUPI(ZOU)的bHLH转录因子，ZOU的突变导师拟南芥种子胚乳滞留且导致胚的发育受阻，故认为ZOU是一个调控胚乳发育的重要转录因子。随后有文献报道在玉米中利用RNA干扰技术将ZOU在玉米中的的直系同源进行基因沉默（也就是ZmbHLH167），但由于RNA干扰后的籽粒仍有45%的残余表达，故并未观察到明显的突变表型。为了对ZmbHLH167进行更为透彻的研究，我们利用CRISPR-Cas9技术将ZmbHLH167进行基因敲除。敲除后发现籽粒明显变小，但籽粒的发芽率并未发生显著变化；生化成分分析发现，胚乳三大营养物质的含量的比例发生显著变化，使得玉米胚乳中较为匮乏的蛋白和油脂的含量均发生显著升高，故为高品质玉米的创造做出重要贡献。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种转录因子ZmbHLH167。本专利技术的目的之二在于提供该转录因子ZmbHLH167的构建方法。本专利技术的目的之三在于提供该转录因子的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种玉米转录因子ZmbHLH167，其特征在于该转录因子具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。一种载体，其特征在于该载体含有上述的转录因子ZmbHLH167。一种构建上述的玉米转录因子ZmbHLH167的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采用pCAMBIA3301为转基因载体，将SEQIDNO:2所示序列作为gRNAspacer和scaffold连入pCAMBIA3301转基因载体中获得，其中pCAMBIA3301载体经过改造，以玉米U6启动子和终止子表达gRNA，同时以玉米泛素启动子和NOS终止子表达玉米密码子优化的Cas9蛋白。一种上述的转录因子ZmbHLH167在控制玉米籽粒大小的应用。一种上述的转录因子ZmbHLH167在玉米胚乳中调控淀粉、蛋白和油脂成分含量中的应用。本专利技术通过生物信息学分析找到胚乳特异高表达的转录因子ZmbHLH167，并通过CRISPR-Cas9基因编辑的方法获得了该转录因子的突变体。通过ZmbHLH167蛋白含量的检测，发现ZmbHLH167突变体中ZmbHLH167蛋白完全缺失。通过表型观察发现ZmbHLH167突变体籽粒显著变小且出现粉质表型。通过发芽率测试，发现ZmbHLH167突变体并不影响籽粒的发芽率。通过生化分析发现，ZmbHLH167突变体胚乳的总淀粉含量显著下降，但总蛋白和总油脂的含量显著升高，为创造高品质玉米提供重要的遗传资源。附图说明图1是ZmbHLH167转基因CRISPR-Cas9载体构建示意图。图2是ZmbHLH167CRISPR-Cas9基因编辑两个阳性事件籽粒（1号事件和4号事件）中ZmbHLH167在基因组水平的编辑情况。图3是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件和6号事件未成熟籽粒中ZmbHLH167在蛋白水平的表达量检测。图4是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件和6号事件成熟籽粒表型观察。图5是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件发芽率检测。图6是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件的总淀粉含量的检测。图7是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件的总蛋白含量的检测。图8是ZmbHLH167CRISPR-Cas94号事件的总油脂含量的检测。具体实施方式下面结合具体实施事例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.）或植物分子生物学－实验手册（PlantMolecularBiology－ALaboratoryManual,MelodyS.Clark编，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一：ZmbHLH167的CRISPR-Cas9转基因载体构建，并用于转基因转化。选取本实验室之前已经构建完毕的适用于玉米的CRISPR-Cas9载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。用PstI酶切载体，将合成的用于转基因的ZmbHLH167特异序列连接guideRNA序列连同玉米U6启动子和终止子插入到载体中（图1），测序正确后，电击转化至EHA105农杆菌菌株。选取PBPA玉米品系的授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程：1.农杆菌侵染10min-共培养20℃3天。2.恢复培养28℃7天-筛选培养（双丙氨磷1.5mg/l）28℃14天。3.筛选培养（双丙氨磷3mg/l）28℃14天3-5轮。4.获得抗性愈伤组织-暗再生培养28℃14-21天。5.光再生培养28℃14-21天-获得阳性苗。6.移入盆中，授粉并获得后代。结果：选取1000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得9个转基因阳性事件。获得后对各个事件进行鉴定，通过TPS法抽提各事件植株的基因组，并针对guideRNA序列所在基因组的位置，设计跨越guideRNA序列PCR引物，扩增得到目的片段后进行TA克隆，挑选阳性克隆进行测序，获得了具有移码突变形式的4号和6号事件（图2）。扩繁保种，用于获得纯合突变体并进行下游分析。证明转基因突变体材料成功获得。实施例二：ZmbHLH167的转基因4号和6号事件移码突变材料中ZmbHLH167表达情况的检测1.取未成熟籽粒8-10颗。2.分别抽提移码突变的ZmbHLH167突变体材料和野生型材料总蛋白。使用液氮研磨达到粉末级，装入EP管中，加入IP裂解液，冰上裂解20min。3.最高转速离心，取上清。两个样品各取4μl的蛋白，加入1μl混有1MDTT的5×SDS蛋白上样缓冲液，99℃变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上。4.SDS-PAGE电泳，堆积胶为5%，80V电泳半小时后，分离胶为12.5%，电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米转录因子ZmbHLH167，其特征在于该转录因子具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种玉米转录因子ZmbHLH167，其特征在于该转录因子具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。2.一种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的转录因子ZmbHLH167。3.一种构建根据权利要求1所述的玉米转录因子ZmbHLH167的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：采用pCAMBIA3301为转基因载体，将SEQIDNO:2所示序列作为gRNAspacer和scaffo...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋任涛，冯帆，祁巍巍，朱晨光，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31