一种抑制α糖苷酶活性的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药领域，具体属于一种抑制α糖苷酶活性的多肽及其应用，尤其涉及天然提取亚麻双功能多肽和原核重组表达多肽，以及它们在功能食品及降糖药物制备中的应用。这些多肽的氨基酸序列具体为：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6。所述多肽可通过从天然亚麻中提取，人工合成、或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。

Polypeptide inhibiting alpha glucosidase activity and application thereof

The invention belongs to the field of biological pharmacy, in particular to a inhibition of alpha glucosidase activity polypeptide and application thereof, in particular to the extraction of natural flax bifunctional polypeptide and recombinant expression polypeptide, and their application in functional foods and drugs in the preparation. The amino acid sequence of these peptides specific for: SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:6. The polypeptides can be obtained by extraction from natural flax, artificially synthesized, or expressed by prokaryotic cells or eukaryotic cells.

【技术实现步骤摘要】
一种抑制α糖苷酶活性的多肽及其应用
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种可口服的抑制α糖苷酶活性的多肽及其衍生物制备和用途。
技术介绍
糖尿病作为一种慢性代谢疾病，具有多种并发症，会对人体的神经系统、泌尿系统以及视觉系统等产生重大的影响。对于糖尿病的临床治疗来说，主要包括两个方面，一方面注射可以降低血糖的胰岛素。另一方面是口服降血糖药物，主要包括：胰岛素促泌剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、双胍类以及噻唑烷二酮类四种口服降糖药。α-葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制小肠中糖类的吸收，延缓D-葡萄糖释放和吸收，以一种非侵害型的方式有效地调节了血糖水平和胰岛素反应。目前α糖苷酶抑制剂的药物多以阿卡波糖、米格列醇、伏格波列糖等有机小分子为主。现在有文献报道的具有α糖苷酶抑制活性的天然植物的产物集中在黄酮类、皂甙类、植物酸类以及多糖。只有豆科的白色扁豆、豇豆、大花田菁中有文献报道存在抑制α糖苷酶蛋白类活性成分。本专利技术中兼具抑制α糖苷酶活性和胰蛋白酶活性的多肽属于首次提及。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制α糖苷酶活性的多肽，所述多肽有的兼具抗胰蛋白酶活性能力。本专利技术提供的一种抑制α糖苷酶活性的多肽(亚麻多肽，简称LUTI)，该多肽的制备，参见专利技术人公开专利“一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂方法”(公开号：CN105566491A)。本专利技术在对多肽的生物学活性测定中，发现该多肽不仅具有胰蛋白酶抑制活性，还具有α糖苷酶抑制活性，适合开发功能食品或口服降糖药物。本专利技术人委托公司对该多肽进行质谱分析，获得了多肽的氨基酸序列信息。所述亚麻多肽，具有序列表SQDIDNO：6所示氨基酸序列。本专利技术又根据LUTI的氨基酸序列序列表SQDIDNO：6，首先进行密码子优化，化学合成适合大肠杆菌表达的编码基因，再经多点氨基酸添加、替代的突变，获得一些或提高α糖苷酶抑制活性，或提高胰蛋白酶抑制活性，或两者均提高的重组多肽，简称DFI，这些多肽具有序列表SQDIDNO：1所示氨基酸序列，其可应用于功能食品、生物制药领域。所述兼具胰蛋白酶抑制活性和α糖苷酶抑制活性重组多肽，具有序列表SQDIDNO：2所示氨基酸序列。所述兼具胰蛋白酶抑制活性和α糖苷酶抑制活性重组多肽，具有序列表SQDIDNO：3所示氨基酸序列。所述具有α糖苷酶抑制活性重组多肽，具有序列表SQDIDNO：4所示氨基酸序列。所述具有α糖苷酶抑制活性重组多肽，具有序列表SQDIDNO：5所示氨基酸序列。上述的任一抑制α糖苷酶活性的多肽可在制备降糖功能食品及口服降血糖药物中应用。本专利技术的抑制α糖苷酶活性的多肽由于兼具胰蛋白酶抑制活性，具有较强的抗肠道蛋白酶水解能力因此可通过口服给药，在Ⅱ型糖尿病治疗中有很好的应用前景。下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步说明。附图说明图1.重组多肽DFI1的制备过程电泳图具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。天然提取或重组表达的多肽的简称代码与序列表中序列号的对应关系为：DFI1(SQDIDNO：2)；DFI2(SQDIDNO：3)；DFI3(SQDIDNO：4)；DFI4(SQDIDNO：5)；LUTI(SQDIDNO：6)实施例1.亚麻多肽氨基酸序列的获得亚麻多肽(简称LUTI)的制备：在专利技术人公开了专利“一种从亚麻蛋白粉中提取胰蛋白酶抑制剂方法”(公开号：CN105566491A)后，对多肽的生物学活性测定中，发现该多肽不仅具有胰蛋白酶抑制活性，还具有α糖苷酶抑制活性。本专利技术人委托公司对该多肽进行质谱分析，获得了多肽的氨基酸序列信息，即具有序列表SQDIDNO：6所示氨基酸序列。实施例2.重组多肽的制备根据LUTI的氨基酸序列，利用商业公司化学合成编码DFI1，DFI2,DFI3,DFI4多肽的核苷酸编码序列，然后利用5’端添加BamHI的正向引物(ATGGATCCAGCCGTCGTTGCCCG)，3’端添加EcoRI的反向引物(ATGAATTCGGTAATATGCGGCAC)，以合成基因为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃5min，95℃30s，53℃30s，72℃40s，72℃10min，30个循环；利用限制性内切酶BamHI、EcoRI对PCR产物进行酶切，连接到经相同酶切割的表达载体质粒pGEX-6p-1，构建pGEX-6p-1-DFI1或DFI2或DFI3或DFI4的重组子，然后将重组子转入E.coliX10感受态细胞中，进行菌落PCR筛选，阳性克隆经测序分析确定。0.5μl浓度为200ng/μl重组质粒pGEX-6p-1-DFI1或DFI2或DFI3或DFI4，迅速转入100μl冻融状态的E.coliOrigami(DE3)感受态中，冰浴30分钟，42℃热击90秒，均匀涂布于LB固体平板培养基(含100μg/mlAmp)表面，37℃倒置过夜培养。次日挑取单菌落于5mlLB(含100μg/ml氨苄青霉素)液体培养基中，37℃、200rpm过夜震荡培养。然后将上述培养液按1％(v/v)的比例接种至500ml新鲜的LB液体培养基(含100μg/mlAmp)中扩大培养至OD600＝0.6～0.7时，加入IPTG使其终浓度达到0.3mM，16℃过夜诱导表达；8000rpm离心收集菌体。用30mLpH7.3磷酸缓冲液重悬菌体，冰上超声裂解菌体，13000r/min离心30min，收集上清，并上样至经pH7.3PBS溶液平衡好的GST-Sepharose4B亲和层析纯化，然后GST-3C蛋白酶切割融合蛋白，再次利用GST-Sepharose4B纯化酶切产物，收集GST-Sepharose4B柱穿透样品，上样至缓冲液为pH7.3磷酸缓冲液平衡的SephacrylS-200凝胶柱，收集目的蛋白，过滤除菌后保存于-80℃。图1为重组多肽DFI1的制备过程电泳图，图中：1、表达GST-DFI1蛋白大肠杆菌BL21全菌样品；2、菌体超声破碎后离心上清样品；3、菌体超声破碎后离心沉淀样品；4、GST-Sepharose4B亲和柱穿透样品；5、GST-Sepharose4B亲和柱纯化样品；6、SephacrylS-200凝胶柱纯化样品；7、GST-DFI1酶切后的混合样；8、重组的DFI1样品。DFI2、DFI3和DFI4的制备过程电泳图同DFI1的基本相同。实施例3.亚麻多肽以及重组多肽体外活性测定α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：以4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)为底物，取一定量的多肽(LUTI或DFI1或DFI2或DFI3或DFI4)溶液与37.5μLpNPG溶液(2×10-3mol/L)混合后，用0.2mol/L磷酸缓冲液中(pH6.8)补足体积至450μL，于37℃恒温水浴保温10min后，加入50μL来源于酵母的α-葡萄糖苷酶(0.5U/mL)，37℃反应10min，加入2.5mL0.1mol/LNa2CO3溶液(pH10.95)终止反应，在410nm处测其吸光值，以不加多肽试样为空白对照。α-葡萄糖苷酶活力单位定义为：37℃下，pH为6.8的缓冲体系中，每分钟水解pNPG生成1μmol/LPNP所需要的酶量为一个活力单位。α-葡萄糖苷酶抑制剂活力单位定义为：在相同条件下，降低一个酶活性单位所需的抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制α糖苷酶活性的多肽，其特征是：所述多肽具有序列表SQD ID NO：1所示氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抑制α糖苷酶活性的多肽，其特征是：所述多肽具有序列表SQDIDNO：1所示氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抑制α糖苷酶活性的多肽，其特征是：所述多肽具有序列表SQDIDNO：2所示氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的抑制α糖苷酶活性的多肽，其特征是：所述多肽具有序列表SQDIDNO：3所示氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的抑制α糖苷酶活性的多肽，其特征是：所述多肽具有序列表S...

【专利技术属性】
技术研发人员：石亚伟，吴莎莎，陈颖璐，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14