一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法技术

本发明专利技术提供了一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法，将培养过程分为两个阶段，并分别使用含有不同浓度的胎牛血清的培养基进行培养，通过逐渐提高培养基中胎牛血清的浓度，以使原代细胞的适应性逐渐增强、活力逐渐提高，细胞增殖较快、得率较高，同时遗传稳定性良好；在培养基中添加丙酮酸钠、柑浓素、Y‑27632以及灰黄霉素，可以防止细菌和真菌感染，并能促进细胞增殖、抑制细胞分化；在冻存液中添加植物源重组人血清白蛋白，可以部分代替胎牛血清，降低胎牛血清的用量，从而在保证效力不变的情况下降低成本。

A method for isolation and preparation of human primary tumor cells

The present invention provides a method for separating and preparing human primary tumor cells, the training process is divided into two stages, which were used in culture medium containing different concentrations of fetal bovine serum were cultured by gradually increasing the concentration of fetal bovine serum culture medium, in order to make the primary cells gradually increased, adaptability cell proliferation activity was gradually improved, faster, higher yield, and good genetic stability; in the medium supplemented with sodium pyruvate, orange, and 27632 Y thick griseofulvin, can prevent bacterial and fungal infections, and can promote cell proliferation and inhibit cell differentiation; adding plant derived recombinant human serum albumin in the frozen liquid, can partially replace fetal bovine serum, reduce the amount of fetal bovine serum, so as to reduce the cost effectiveness in the case of constant assurance.

【技术实现步骤摘要】
一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法
本专利技术属于原代细胞培养
，特别涉及一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法。
技术介绍
细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养也称初代培养，是直接从生物体获取组织或器官的一部分，经机械法或各种酶类(常用胰蛋白酶)和鳌合剂(常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。严格地说，原代培养是指从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段；但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养过程一般持续1～4周，在此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似程度很高。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后进行传代培养创造条件。现有的原代培养方法，多是通过在培养基中添加血清来为细胞提供营养。但是血清成本较高，如果培养过程中一直使用含有同一浓度血清的培养基，会导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：原代肿瘤细胞的分离：采集肿瘤组织，清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，并切割成组织碎块；S2：第一培养阶段：将所述组织碎块接种于细胞培养瓶中，加入1～5mL的含低浓度胎牛血清的RPMI‑1640培养基，培养2～3周；S3：第二培养阶段：更换含有高浓度胎牛血清的RPMI‑1640培养基，继续培养至细胞融合度达到70～80％；S4：细胞收获及冻存：将得到的细胞进行消化收获，向收获的细胞中加入冻存液，并进行冻存。

【技术特征摘要】
1.一种人原代肿瘤细胞的分离制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：原代肿瘤细胞的分离：采集肿瘤组织，清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，并切割成组织碎块；S2：第一培养阶段：将所述组织碎块接种于细胞培养瓶中，加入1～5mL的含低浓度胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养2～3周；S3：第二培养阶段：更换含有高浓度胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养至细胞融合度达到70～80％；S4：细胞收获及冻存：将得到的细胞进行消化收获，向收获的细胞中加入冻存液，并进行冻存。2.如权利要求1所述的人原代肿瘤细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S1的具体方法如下：采集肿瘤组织，在无菌状态下转移至培养皿中，用5～10mL质量分数为0.9％的氯化钠水溶液冲洗，重复2～3次，去除血渍，并切除坏死组织和结缔组织，剪成1mm3的组织碎块。3.如权利要求1所述的人原代肿瘤细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：S2.1：将组织碎块接种于T25培养瓶中，加入1～5mL含50mg/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，将组织块均匀铺于培养瓶底部，置于37℃的CO2培养箱中培养；S2.2：每隔3～4天进行一次全量换液，弃去旧培养基，同时添加等量的新鲜培养基，置于CO2培养箱中继续培养；S2.3：培养7～10天后，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱落；将旧培养基与脱落的组织块一并转移并使用100μm的滤膜过滤，收集滤液，在1500～2000rpm/min条件下离心5min，收集沉淀，加入新的培养基，继续培养1～2周。4.如权利要求1所述的人原代肿瘤细胞的分离制备方法，其特征在于，所述步骤S3的具体方法如下：第一培养阶段培养2～3周后，弃去旧培养基，换用含有100mg/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，每3～4天进行一次全量换液，培养至细胞融合度达到70～80％时为止。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞云，潘新，贺伟，刘世红，卢家堃，
申请(专利权)人：北京世纪劲得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11