一种活体细胞玻璃化冷冻液及冷冻复苏的方法技术

本发明专利技术提供了一种活体细胞玻璃化冷冻液及冷冻复苏的方法。本发明专利技术提供的冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加50‑60nmol/L的异嗪皮啶、20‑30nmol/L的绿原酸和40‑48μmol/L的保护剂；所述保护剂包括羟乙基淀粉、茶多酚、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、香菇多糖、腺嘌呤核苷三磷酸中的一种或多种。本发明专利技术提供的活体细胞玻璃化冷冻液能够提高活体细胞的存活率、体外受精发育率、卵裂率和囊胚率。

A Vitrified Cryopreservation Solution for Living Cells and a Method of Cryopreservation and Resuscitation

The invention provides a vitrification freezing liquid for living cells and a method for freezing and resuscitation. The freezing solution provided by the invention is based on MEM medium and F12 medium with a volume ratio of 1:1, and is supplemented with 50 60 nmol/L isopyridine, 20 30 nmol/L chlorogenic acid and 40 48 micromol/L protective agent, which includes hydroxyethyl starch, tea polyphenol, 4 hydroxyethyl piperazine ethylsulfonic acid, lentinan, one or more of adenine nucleoside triphosphates. The vitrified cryopreservation solution provided by the invention can improve the survival rate of living cells, in vitro fertilization and development rate, cleavage rate and blastocyst rate.

【技术实现步骤摘要】
一种活体细胞玻璃化冷冻液及冷冻复苏的方法
本专利技术涉及玻璃化冷冻
，特别涉及一种活体细胞玻璃化冷冻液及冷冻复苏的方法。
技术介绍
活体细胞包括但不限于卵细胞、早期胚胎、囊胚等，其中卵子的冷冻价值巨大，在珍稀动物、实验动物保种和再生医学研究等领域具有重要的研究和应用价值，然而目前的卵子冷冻技术并不成熟，使用目前冷冻技术存在复苏后卵子存活率低、发育成囊胚率低，流产率升高等弊端。有些情况下，每次手术只能获得1个可用的卵细胞，因此，冷冻液、卵细胞的冻存和复苏技术对于移植的成功率起着至关重要的作用。
技术实现思路
为了解决现有技术中存活率低、囊胚率低等问题，本专利技术提供了一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液能够提高活体细胞冷冻复苏后的存活率、体外受精发育率、卵裂率和囊胚率。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加50-60nmol/L的异嗪皮啶、20-30nmol/L的绿原酸和40-48μmol/L的保护剂；所述保护剂包括羟乙基淀粉、茶多酚、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、香菇多糖、腺嘌呤核苷三磷酸中的一种或多种。其中，MEM培养基和F12培养基均购自上海康朗生物科技有限公司；本专利技术通过使用MEM培养基、F12培养基、异嗪皮啶、绿原酸和保护剂，多种成分协同作用，为待冻存的细胞提供充分的营养成分，进而提高活体细胞冻存复苏后的存活率。进一步的改进，保护剂包括10-20μmol/L的羟乙基淀粉、20-30μmol/L的香菇多糖和5-7μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸。本专利技术通过添加羟乙基淀粉、香菇多糖和腺嘌呤核苷三磷酸，能够进一步地提高活体细胞冻存复苏后的存活率。进一步的改进，冷冻液还包括5-10mg/L的转铁蛋白、10-20mg/L的丙三醇和20-30mg/L的咖啡酸。本专利技术通过在冷冻液中添加转铁蛋白、丙三醇和咖啡酸，能够进一步为细胞提供营养物质，提高体外受精发育率。本专利技术还提供了一种活体细胞玻璃化冷冻方法，冷冻方法包括以下步骤：(1)获取离体的活体细胞，将离体的活体细胞进行预培养，制得预培养活体细胞；(2)将步骤(1)制得的预培养活体细胞转移于脱水液中脱水30-40s，制得失水活体细胞；(3)将步骤(2)制得的失水活体细胞转移至含渗透性低温保护及的平衡液中渗透平衡2-3min，制得平衡活体细胞；(4)将步骤(3)制得的平衡活体细胞转移至冷冻液中混合均匀制得混合液，将混合液装入冷冻脉管内封存，投入液氮罐中保存。其中，步骤(2)中预培养活体细胞脱水时，脱水液没过预培养细胞；步骤(3)中失水活体细胞平衡时，平衡液没过失水活体细胞。进一步的改进，预培养的具体方法为：将离体的活体细胞浸泡在F12培养基中，置于37℃、5％CO2条件下的恒温培养箱内培养40-60min，即得预培养活体细胞。其中，离体的活体细胞始终浸没于F12培养基中；本专利技术通过以上方法冻存活体细胞，能够显著地提高冷冻复苏后的卵裂率和囊胚率。进一步地，脱水液包括10-20mg/L的甘露醇和40-60mg/L的蔗糖。本专利技术通过具体限定脱水液的组成成分，能够进一步地提高活体细胞冻存复苏后的囊胚率。进一步地，平衡液以MEM培养基为基础添加4-10mg/L的维生素B2、2-4mg/L的褪黑素和10-20mg/L的N-乙酰半胱氨酸。其中，MEM培养基购自北京赛因坦科技有限公司；本专利技术通过具体限定平衡液的组成成分，能够提高冷冻复苏后的活体细胞的卵裂率。本专利技术还提供了一种复苏方法，具体包括以下步骤：a：将装有活体细胞的冷冻脉管从液氮中取出，于37℃水浴中解冻30-40s；b：剪去步骤a水浴后的冷冻脉管的一端，从冷冻脉管中取出内容物，放置于复苏液中解冻40～60s，制得解冻活体细胞；c：将步骤b制得的解冻活体细胞转移至平衡液中平衡30-40s，得第二平衡活体细胞；d：将步骤c制得的第二平衡活体细胞离心5-10min，去掉上清液，取沉淀。进一步的改进，复苏液包括浓度为1-2μg/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、80-100ng/L的胶纸细胞源性神经营养因子、60-80mg/L的透明质酸和8-10μg/L的多聚赖氨酸。本专利技术提供的复苏方法和复苏液能够进一步地提高冷冻复苏后的活体细胞的体外受精发育率。本专利技术另一方面提供了上述活体细胞玻璃化冷冻液在活体细胞冻存中的应用。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的活体细胞玻璃化冷冻液能够提高活体细胞的存活率、体外受精发育率、卵裂率和囊胚率。具体实施方式实施例1一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加50nmmol/L的异嗪皮啶、20nmol/L的绿原酸和40μmol/L的保护剂；所述保护剂为腺嘌呤核苷三磷酸。实施例2一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括22μmol/L的茶多酚和22μmol/L香菇多糖。实施例3一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加60nmol/L的异嗪皮啶、30nmol/L的绿原酸和48μmol/L的保护剂；所述保护剂包括12μmol/L的羟乙基淀粉、10μmol/L茶多酚、10μmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸、8μmol/L香菇多糖和8μmol/L腺嘌呤核苷三磷酸。实施例4一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括10μmol/L的羟乙基淀粉、20μmol/L的香菇多糖和5μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸。实施例5一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括15μmol/L的羟乙基淀粉、25μmol/L的香菇多糖和6μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸。实施例6一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括20μmol/L的羟乙基淀粉、30μmol/L的香菇多糖和7μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸。实施例7一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括15μmol/L的羟乙基淀粉、25μmol/L的香菇多糖和6μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸；冷冻液还包括5mg/L的转铁蛋白、10mg/L的丙三醇和20mg/L的咖啡酸。实施例8一种活体细胞玻璃化冷冻液，该冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加55nmol/L的异嗪皮啶、25nmol/L的绿原酸和44μmol/L的保护剂；所述保护剂包括15μmol/L的羟乙基淀粉、25μmol/L的香菇多糖和6μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活体细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，所述冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加50‑60nmol/L的异嗪皮啶、20‑30nmol/L的绿原酸和40‑48μmol/L的保护剂；所述保护剂包括羟乙基淀粉、茶多酚、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、香菇多糖、腺嘌呤核苷三磷酸中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种活体细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，所述冷冻液以体积比为1:1的MEM培养基和F12培养基为基础，添加50-60nmol/L的异嗪皮啶、20-30nmol/L的绿原酸和40-48μmol/L的保护剂；所述保护剂包括羟乙基淀粉、茶多酚、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、香菇多糖、腺嘌呤核苷三磷酸中的一种或多种。2.如权利要求1所述的活体细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，所述保护剂包括10-12μmol/L的羟乙基淀粉、20-25μmol/L的香菇多糖和10-11μmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸。3.如权利要求1所述的活体细胞玻璃化冷冻液，其特征在于，所述冷冻液还包括5-10mg/L的转铁蛋白、10-20mg/L的丙三醇和20-30mg/L的咖啡酸。4.一种活体细胞玻璃化冷冻方法，其特征在于，所述冷冻方法包括以下步骤：(1)获取离体的活体细胞，将离体的活体细胞进行预培养，制得预培养活体细胞；(2)将步骤(1)制得的预培养活体细胞转移于脱水液中脱水30-40s，制得失水活体细胞；(3)将步骤(2)制得的失水活体细胞转移至含渗透性低温保护及的平衡液中渗透平衡2-3min，制得平衡活体细胞；(4)将步骤(3)制得的平衡活体细胞转移至冷冻液中混合均匀制得混合液，将混合液装入冷冻脉管内封存，投入液氮罐中保存。5.如权利要求4所述的活体细胞玻璃化冷冻方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋莉莉，董明珠，刘世红，潘新，李帅民，
申请(专利权)人：北京世纪劲得生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11