本发明专利技术公开了一种体外模拟人肿瘤转移的体外模型，模型内细胞具有肿瘤高转移特性。由人肿瘤高转移细胞系细胞以微球形水凝胶支架的建立、肿瘤细胞体外转移模型的建立、对所构建的肿瘤体外转移模型鉴定三部分构建而成。本发明专利技术的模型在体外三维培养肿瘤细胞成团生长，可检测转移中的肿瘤细胞生物学行为。该模型对于进行临床肿瘤转移机制的研究和控制转移药物的筛选有重要价值，并可作为制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，属于肿瘤侵袭转移体外模型
技术介绍
肿瘤转移的过程是复杂而难以控制的，临床肿瘤病人的90%死亡率是由肿瘤转移导致的。某种程度上说，防止肿瘤转移即能控制肿瘤所致的死亡。肿瘤侵袭与转移是肿瘤细胞的恶性生物学行为，肿瘤侵袭也称为肿瘤直接扩散(direct spread)，瘤细胞不连续性播散，并在远隔部位生长的过程为转移(metastasis)。上述过程是一个复杂的、多步骤的过程，大致包括肿瘤细胞从原发肿瘤灶脱离；降解基底膜，向外浸润、迁移并粘附于血管内皮细胞；进入循环系统随着血流，到达并停留于远处的血管壁；穿过血管侵入细胞外基质，最后在特定的组织或器官形成转移灶。近年来随着分子生物学的发展，发现此过程分别受“转移相关基因”和“转移抑制相关基因”的调控，并且转移过程与各种细胞因子的功能失调密切相关。由于转移过程的复杂性，肿瘤转移的分子和细胞机制尚未真正阐述清楚。肿瘤转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖、侵袭)、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成及靶器官性质等许多因素有关，而对于肿瘤转移机制以及抗肿瘤转移的评价手段的研究，不可能完全利用人体活检和尸检材料去完成，必需建立相应的动物和人类肿瘤的转移模型。对于肿瘤转移机制，实验治疗的探索是重要的工具和手段。在体外肿瘤侵袭转移模型中，传统的平面培养 的转移性人肿瘤细胞系已经无法满足肿瘤侵袭转移分子病理机制的实验解析，且目前报道的大量平面培养的细胞系的表达与行为方面与体内癌细胞真实病理情况相差甚远[参考文献:Pampaloni, F.，E.G.Reynaud, et al.(2007). The thirddimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature ReviewsMolecular Cell Biology8(10):839-845.]，而三维培养的类组织细胞球更接近体内肿瘤微环境内细胞的表达与行为，又因为体外三维培养易于大规模操作等优点，应用体外三维模型来探索和建立新型体外侵袭转移模型或转移研究体系可以为肿瘤转移新理论、新机制提供指导。传统的平面培养细胞性状均一无极性，细胞形态影响细胞骨架，由此影响细胞的分泌功能及部分关键基因的异常表达，且平面培养细胞无法反映细胞与细胞之间，细胞与基质之间等相互作用，从而缺少有利的实验证据对细胞间粘附、信号转导、细胞运动侵袭转移等生物学过程进行体外模拟研究。体外三维培养技术克服了上述平面培养的不足，较好的模拟再现细胞在组织体内接近真实的生存状况，在细胞功能研究上，体外三维培养技术具有明显的优势，主要包括(I)简化体内复杂微环境，提供易于重复、规模化研究的特定体外模拟培养环境，有利于三维状态下细胞的分化，生长等生理病理特征解析。(2)在特定培养体系中，提高了同种细胞、异种细胞间的相互作用，结构上易于建立起与肿瘤转移密切相关的细胞间连接特性，比如缝隙连接，桥粒连接。⑶增强胞外基质的产量，易于观察胞外基质对细胞生长、分化、迁移等细胞生物学特征的影响。(4)体现出肿瘤细胞的肿瘤恶性度相关基因表达状况和相关功能特征。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建既可以较好的模拟体内肿瘤的生存环境，也有助于肿瘤细胞的恶性生物学行为实验解析的理想体外转移性肿瘤组织模型，解决体外研究肿瘤组织细胞病理特征缺少理想具有转移特性的实验模型问题以及肿瘤临床药物治疗缺少理想体外实验评估体系问题，提供可规模化的，易于重复研究又相对简化的肿瘤生长并具有转移特性的特定体外模拟培养环境。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，具体步骤为:第一步:将人肿瘤细胞混悬在8_40g/L海藻酸钠溶液中，利用锐孔挤压法使液滴喷射入含CaCl2凝胶浴，室温下反应10-40min生成粒径为200-800 μ m水凝胶微球，具有良好的单分散性；第二步:将上述水凝胶微球自然沉降3-10min，沉降后按照5_15%的体积接种到含体积浓度8-15%胎牛血清的人肿瘤细胞培养基中，静置3-10min后，于培养箱中培养，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿度条件下培养人肿瘤细胞，培养基的种类依据所选定的肿瘤细胞确定。所述对构建的肿瘤体外侵袭转移模型鉴定的指标特征是:①平面培养细胞逐渐伸展，铺成单细胞层，而三维培养细胞为球形生长，细胞与细胞之间连接紧密，随着时间的增加细胞团粒径越来越大，成为细胞类组织体；②在培养一段时间之后，利用实时定量PCR(聚合酶链式反应)检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的转移相关的基因表达有显著上调在培养一段时间之后，利用明胶酶谱检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的转移相关的蛋白表达有显著上调在培养一段时间之后，利用细胞侵袭转移实验检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的侵袭转移能力有显著增强；⑤在培养一段时间之后，利用裸鼠体内 成瘤实验检测，与平面培养细胞相比，三维培养细胞球的体内成瘤能力有显著增强。所述的海藻酸钠溶液的粘度为40_380pas。所述的凝胶浴条件为0.01-1.0mol/L CaCl2溶液。所述的锐孔挤压法为一种公知的技术，比如静电液滴法或气动液滴法。为简明起见，本专利技术对这些公知技术不作详细描述。有关这些公知技术的详细报道可参阅:静电液滴法[参阅文献:HommelM, Sun AM, Goosen MFA.Droplets generation.Canadian patent N0.1241598,1988]；气动液滴法[参阅文献:MiyawakiO, Nakamura K, Yano T.Agric.Biol.Chem.1980,44:2865-2870]；所述水凝胶微球在培养3天后，半数换液，之后每两天半数换液，培养基的种类依据所选定的肿瘤细胞确定，培养10-20天后三维培养结束，得到海藻酸钙凝胶微球中类组织体的粒径在50-200 μ m。本专利技术技术方案中转移性肿瘤类组织体形成的时间周期为10-20天，该时间段的界定主要来自组织病理、光学显微形态学观察，肿瘤特异基因和蛋白表达，细胞侵袭转移实验，裸鼠成瘤动物实验，对化疗药物的敏感程度。肿瘤侵袭转移类组织形成中，细胞增殖相对缓慢，有潜伏期，而且由单个细胞增殖造成，而非细胞聚集造成，这与体内情况十分相似。白蛋白表达比平面细胞高，说明该类组织体在适宜其生长的微环境中具有部分肝组织的特性。肿瘤及其转移相关基因的表达或肝脏特异基因的表达是评价类组织体能否成为体外肿瘤模型的关键。对转移相关基因MMP2(基质金属蛋白酶2)，MMP7(基质金属蛋白酶7) ,MMP9 (基质金属蛋白酶9) ,MTl-MMP (基质金属蛋白酶14)等表达进行检测，对粘附相关基因E-cadherin(E I丐粘蛋白)，Integrin (整合素)，⑶44等表达进行检测,对胞外基质相关基因CollagenI (I型胶原)，Collagen IV(IV型胶原)，VCAN(硫酸软骨素)等表达进行检测，发现与平面培养相比，转移相关基因基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶7，基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶14,粘本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，其特征在于：由人肿瘤细胞经水凝胶体系包埋形成微球，并培养得到，微球内形成具有侵袭转移能力的肿瘤类组织体。
【技术特征摘要】
1.一种人肿瘤侵袭转移型类组织的体外三维模型，其特征在于:由人肿瘤细胞经水凝胶体系包埋形成微球，并培养得到，微球内形成具有侵袭转移能力的肿瘤类组织体。2.如权利要求1所述的体外三维模型，其特征在于:所述的肿瘤细胞为实体瘤细胞，包括肝癌细胞、头颈部鳞癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、子宫癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞或食道癌细胞中的一种。3.一种权利要求1所述体外三维模型的构建方法，其特征在于: 第一步:将人肿瘤细胞混悬在8-40g/L海藻酸钠溶液中，利用锐孔挤压法使液滴喷射入含CaCl2凝胶浴，室温下反应10-40min生成粒径为200-800 μ m水凝胶微球，具有良好的单分散性； 第二步:将上述水凝胶微球自然沉降，沉降后按照5-15%的体积接种到含体积浓度8-15%胎牛血清的人肿瘤细胞培养基中，静置3-10min后，于培养箱中培养，在37°C，含体积分数5% CO2的空气饱和湿...
【专利技术属性】
技术研发人员：马小军，徐小溪，孙广炜，于炜婷，王为，李楠，刘畅，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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