龙胆苦苷的人工抗原制备及间接竞争ELISA检测的建立方法技术

本发明专利技术提供一种龙胆苦苷的人工抗原制备及间接竞争ELISA检测的建立方法，采用琥珀酸酐法对药用有效成分龙胆苦苷进行结构修饰，获得半抗原羧基化龙胆苦苷；分别利用混合酸酐法，将羧基化的龙胆苦苷与两种载体蛋白BSA和OVA偶联制备得到相应的两种人工抗原；并通过动物免疫制备抗龙胆苦苷抗体，基于此抗体建立了灵敏度较好、特异性较强的龙胆苦苷‑ELISA检测方法。为龙胆苦苷的检测开辟了新路径，提供了新思路和新技术，为快速寻找新药源和快速鉴别药材真伪提供了平台。

Preparation of artificial antigen of gentiopicroside and establishment of indirect competitive ELISA for detection of gentiopicroside

The invention provides a method for establishing artificial antigen for the preparation of gentiopicroside and indirect competitive ELISA detection, using succinic anhydride method on structural modification of medicinal components of gentiopicroside, obtain hapten carboxyl gentiopicroside; using mixed anhydride method, the gentiopicroside carboxylated and two carrier proteins BSA and OVA were prepared by coupling two artificial antigen corresponding; and through the animal immune preparation of anti gentiopicroside antibody, the antibody based on good sensitivity and strong specificity of gentiopicroside ELISA detection method was established. It opens up a new way for the detection of gentiopicroside, and provides new ideas and new techniques, which provides a platform for rapid search of new drugs and rapid identification of authenticity of medicinal materials.

【技术实现步骤摘要】
龙胆苦苷的人工抗原制备及间接竞争ELISA检测的建立方法
本专利技术属于多克隆抗体领域，具体涉及龙胆苦苷半抗原、人工抗原、多克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立。
技术介绍
龙胆苦苷(Gentiopicroside，GTP)为裂环环烯萜苷类化合物，属于半萜类物质，分子式为C16H20O9，分子量为356.32，白色针状晶体，易溶于甲醇。是药用植物秦艽中最主要有效成分，存在于龙胆科龙胆属植物中，具有特殊的药理活性，主要包括镇痛、抗菌、抗炎、抗病毒、保肝利胆、健胃、降压等功效。龙胆苦苷目前在临床中应用极为广泛，随着对龙胆苦苷药理作用的不断开发利用，使得其野生资源保有量急剧下降，中药秦艽已被列为国家三级保护药材，市场上难免会有假冒伪劣的秦艽药材出现，所以，建立简单高效的中药有效成分检测技术为成为当务之急。酶联免疫吸附测定法(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)对于小分子化合物的检测与分析是一种新兴技术，目前，在中药有效成分的检测分析中得以广泛应用。建立ELISA方法的基本路线是通过中药有效成分人工抗原的合成制备多克隆抗体或单克隆抗体，并建立ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种龙胆苦苷人工抗原，其特征在于：该人工抗原包括含有羧基的龙胆苦苷半抗原分子以及通过所述羧基与该半抗原分子偶联的载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA，所述半抗原分子的结构如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种龙胆苦苷人工抗原，其特征在于：该人工抗原包括含有羧基的龙胆苦苷半抗原分子以及通过所述羧基与该半抗原分子偶联的载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA，所述半抗原分子的结构如式I所示：2.一种龙胆苦苷人工抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)采用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰将55～60mg龙胆苦苷、95～105mg琥珀酸酐及3～5mL吡啶混合后于100～115℃回流7～13h，得反应液，将反应液以及3～5mL质量分数36～38％盐酸与18～22mL的≤4℃蒸馏水混合后用氯仿萃取，除去氯仿层后通过减压蒸馏得棕色粉末，即为龙胆苦苷半抗原，记为GTP-SA；2)利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA或鸡卵清蛋白OVA。3.根据权利要求2所述的龙胆苦苷人工抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：2.1)将15～25mgGTP-SA、0.4～0.6mL二甲基甲酰胺以及70～80μL三正丁胺混合后冷却至0～1℃，得混合物，向混合物中加入15～25μL氯甲酸异丁酯后于9～11℃下搅拌25～35min，得到反应液A；2.2)将65～75mg牛血清白蛋白BSA和65～75mg鸡卵清蛋白OVA分别加入至5～7mL二甲基甲酰胺:水的体积比为1:3～5的混合溶剂中，得到含有BSA的反应液B1和含有OVA的反应液B2；2.3)将反应液A平均分成2份，分别加入至反应液B1和B2中于0～1℃搅拌混匀，得到混合后的反应液A-B1和A-B2，将A-B1和A-B2置于3～5℃下搅拌10～12h；然后，将A-B1和A-B2分别装入截留分子量为8000～14000的透析袋中，以磷酸盐缓冲液为透析液，在3～5℃下透析3～4天，在透析处理期间，每间隔5～7小时换一次透析液；然后，将透析处理后的A-B1进行冷冻干燥，得龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA，将透析处理后的A-B2进行冷冻干燥，得龙胆苦苷人工抗原GTP-OVA。4.一种龙胆苦苷间接竞争ELISA检测的建立方法，其特征在于：该建立方法包括以下步骤：1)利用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰，得到含有羧基的龙胆苦苷半抗原；2)利用混合酸酐法将龙胆苦苷半抗原分别与牛血清白蛋白BSA及鸡卵清蛋白OVA偶联，制备得到相应的两种龙胆苦苷人...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱卫东，刘婵婵，王婷，吴启航，曾桥，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61