雷公藤甲素人工抗原及制备方法和多克隆抗体技术

本发明专利技术公开了一种雷公藤甲素人工抗原及制备方法和多克隆抗体，涉及免疫学领域。雷公藤甲素人工抗原由雷公藤甲素、对氨基苯甲酸以及载体蛋白偶联而成。其制备方法其包括：将对氨基苯甲酸重氮化；将重氮化的对氨基苯甲酸与雷公藤甲素偶联，形成复合物；将所述复合物与载体蛋白偶联，即得雷公藤甲素人工抗原。雷公藤甲素多克隆抗体，其由雷公藤甲素人工抗原免疫动物，并获取动物的血清而得。雷公藤甲素人工抗原和多克隆抗体构成酶联免疫检测体系，实现对雷公藤甲素的快速检测，具有方便、灵敏度高的特点。

【技术实现步骤摘要】
雷公藤甲素人工抗原及制备方法和多克隆抗体
本专利技术涉及免疫学领域，尤其是雷公藤甲素人工抗原及制备方法和多克隆抗体。
技术介绍
蜂蜜具有抗菌、抗氧化、提高人体免疫力等多种生理功能，是食疗并举的农产品，深受人们的喜爱。蜂蜜质量和安全一直都受到社会各界的高度关注。我国的蜂蜜国家标准《食品安全国家标准蜂蜜》(GB14963-2011)中明确规定蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤、博落回、狼毒有毒蜜源植物。雷公藤分布在我国长江以南及西南地区。蜜蜂在蜜源较少的情况下，会将雷公藤植物作为其蜜源，导致剧毒的雷公藤活性成分进入蜂蜜中。如人们误食此类有毒蜂蜜，会引起中毒甚至死亡。关于蜂蜜中雷公藤活性成分的检测方法报道较少，迫切需要开发新型、快速、灵敏的雷公藤活性成分检测体系。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种雷公藤甲素人工抗原及制备方法和多克隆抗体，其中雷公藤甲素人工抗原和多克隆抗体了构成酶联免疫检测体系，对雷公藤甲素进行检测，具有简单、快速、灵敏的特点。本专利技术采用的技术方案如下：一种雷公藤甲素人工抗原，其由雷公藤甲素、对氨基苯甲酸以及载体蛋白偶联而成。由于雷公藤甲素属于小分子化合物，不能直接作为抗原免疫动物得到抗体，而与载体蛋白结合后，形成蛋白大分子，因而具有抗原的功能。对氨基苯甲酸其连接桥的作用，保证雷公藤甲素与载体蛋白的稳定连接。本专利技术较佳的实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。当载体蛋白为牛血清白蛋白时，复合物为免疫抗原，用该抗原能制备雷公藤甲素多克隆抗体。当载体蛋白为卵清蛋白时，由于其比牛血清白蛋白具有更好的免疫原性，可用于筛选单克隆抗体细胞株。一种的雷公藤甲素人工抗原的制备方法，其包括：将对氨基苯甲酸重氮化；将重氮化的对氨基苯甲酸与雷公藤甲素偶联，形成复合物；将所述复合物与载体蛋白偶联，即得雷公藤甲素人工抗原。由于雷公藤碱属于小分子化合物，不能直接作为抗原免疫动物得到抗体，首先将对氨基苯甲酸重氮化后与雷公藤甲素偶联，偶联后引入羧基（—COOH），然后采用混合酸酐法将雷公藤甲素—对氨基苯甲酸与载体蛋白进行偶联，从而形成稳定的雷公藤甲素—对氨基苯甲酸-载体蛋白复合物，即抗原。本专利技术较佳的实施例中，将雷公藤甲素—对氨基苯甲酸重氮化包括：将对氨基苯甲酸溶于酸盐中，得到对氨基苯甲酸溶液，冰浴搅拌下加入NaNO2，低温避光搅拌，加入苯胺至溶液变为深黄色。本专利技术较佳的实施例中，所述盐酸的浓度为0.8-1.5mol/L，所述对氨基苯甲酸与所述NaNO2的质量之比为5-7：1。由于采取了上述技术方案，对氨基苯甲酸被重氮化，为其物雷公藤甲素的偶联提供结构基础。本专利技术较佳的实施例中，将重氮化的对氨基苯甲酸与雷公藤甲素偶联包括：将雷公藤甲素全完溶于水中得到雷公藤甲素溶液，所述雷公藤甲素溶液与重氮化的对氨基苯甲酸混合，调节pH8-9，搅拌1-3h，离心取上清，分别加入催化量的三丁胺和氯甲酸异丁酯，低温搅拌20-30min。本专利技术较佳的实施例中，所述雷公藤甲素与所述对氨基苯甲酸的质量之比为3-5:4-6。由于采取了上述技术方案，重氮化的对氨基苯甲酸与雷公藤甲素稳定偶联，并在复合物中引入羧基，为复合物与载体蛋白的偶联提供结构基础。本专利技术较佳的实施例中，将所述复合物与载体蛋白偶联包括：将牛血清白蛋白溶于PBS，得到牛血清白蛋白溶液，往所述牛血清白蛋白溶液中加入二甲基甲酰胺。本专利技术较佳的实施例中，所述牛血清白蛋白与所述雷公藤甲素的质量之比为15-20:1。由于采取了上述技术方案，复合物与牛血清白蛋白偶联，形成稳定的雷公藤甲素—对氨基苯甲酸-牛血清白蛋白免疫抗原。一种雷公藤甲素多克隆抗体，其由上述的雷公藤甲素人工抗原免疫动物，并获取动物的血清而得。需要说明的是，所述动物可以是小鼠，羊，兔，但绝不仅限与上述动物。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：将小分子化合物雷公藤甲素与载体蛋白偶联，使其成为抗原，具有免疫原性，并用该抗原免疫动物得到雷公藤甲素多克隆抗体，抗原抗体结合构成酶联免疫检测体系，实现对雷公藤甲素的快速检测，具有方便、灵敏度高的特点。附图说明本专利技术将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1是各物质的紫外分光光度计检测鉴定图。图2是偶联牛血清白蛋白的SDS-PAGE检测图。图3是多克隆抗体的Westernblot分析图。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例1本实施例提供一种雷公藤甲素人工抗原及其制备方法。本方法中使用牛血清白蛋白作为载体蛋白，制备在一种免疫抗原。具体地：S1：称取对氨基苯甲酸24mg，溶于3mL1mol/LHCl中，完全溶解后得到对氨基苯甲酸溶液，置于冰水浴中搅拌至内外温度平衡。S2：称取NaNO24mg，加水完全溶解后加入对氨基苯甲酸溶液，4℃下避光搅拌10min。S3：加入催化量的苯胺（2μL）至溶液变为深黄色，得到重氮化的对氨基苯甲酸溶液，保存备用。S4：称取雷公藤甲素19.2mg，溶于3mL超纯水中，超声5min至完全溶解后，与重氮化的对氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。S5：调节混合液PH至8.5，磁力搅拌2h，离心取第一上清液。S6：向第一上清液中加入5μL三丁胺，3.8μL氯甲酸异丁酯，4℃下磁力搅拌25min，得到复合物。S7：称取326.4mgBSA，溶解于5mLPBS（磷酸盐缓冲液）中，完全溶解后冰水浴、磁力搅拌下加入5mLDMF，得到BSA溶液。S8：将复合物加入BSA溶液，4℃下磁力搅拌过夜，离心取第二上清液。S9：第二上清液用0.01mol/LPH7.4PBS透析一周，第1天每4h换介质一次，第2-4天没8h换介质一次，然后每天换介质一次。S10：透析完成，取透析液，经冷冻干燥后得到雷公藤甲素人工抗原，-20℃保存备用。实施例2本实施例提供一种雷公藤甲素人工抗原及其制备方法。本方法中使用牛血清白蛋白作为载体蛋白，制备在一种免疫抗原。具体地：S1：称取对氨基苯甲酸22.5mg，溶于3mL0.8mol/LHCl中，完全溶解后得到对氨基苯甲酸溶液，置于冰水浴中搅拌至内外温度平衡。S2：称取NaNO24.5mg，加水完全溶解后加入对氨基苯甲酸溶液，4℃下避光搅拌10min。S3：加入催化量的苯胺（2μL）至溶液变为深黄色，得到重氮化的对氨基苯甲酸溶液，保存备用。S4：称取雷公藤甲素11.25mg，溶于3mL超纯水中，超声5min至完全溶解后，与重氮化的对氨基苯甲酸溶液混合，得到混合液。S5：调节混合液PH至8，磁力搅拌1h，离心取第一上清液。S6：向第一上清液中加入5μL三丁胺，3.8μL氯甲酸异丁酯，4℃下磁力搅拌30min，得到复合物。S7：称取225mgBSA，溶解于5mLPBS（磷酸盐缓冲液）中，完全溶解后冰水浴、磁力搅拌下加入5mLDMF，得到BSA溶液。S8：将复合物加入BSA溶液，4℃下磁力搅拌过夜，离心取第二上清液。S9：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雷公藤甲素人工抗原，其特征在于，其由雷公藤甲素、对氨基苯甲酸以及载体蛋白偶联而成。

【技术特征摘要】
1.一种雷公藤甲素人工抗原，其特征在于，其由雷公藤甲素、对氨基苯甲酸以及载体蛋白偶联而成。2.根据权利要求1所述的雷公藤甲素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。3.根据权利要求1或2所述的雷公藤甲素人工抗原的制备方法，其特征在于，其包括：将对氨基苯甲酸重氮化；将重氮化的对氨基苯甲酸与雷公藤甲素偶联，形成复合物；将所述复合物与载体蛋白偶联，即得雷公藤甲素人工抗原。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，将对氨基苯甲酸重氮化包括：将对氨基苯甲酸溶于盐酸中，得到对氨基苯甲酸溶液，冰浴搅拌下加入NaNO2，低温避光搅拌，加入苯胺至溶液变为深黄色。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为0.8-1.5mol/L，所述对氨基苯甲酸与所述NaNO2的质量之比为5-7：1。6.根据权利要求3所述的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林玲，刘佳，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50