一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法技术

本发明专利技术公开了一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，属于生物化工领域中的蛋白质层析分离技术。具体步骤如下：1)发酵液预处理，取含有人血白蛋白的酵母发酵液，离心去除酵母细胞，加入辛酸钠，加热，去除杂蛋白和灭活蛋白酶，离心分离，取上清液；2)柱层析，采用色氨酸为配基的混合模式介质，固定床层析分离上清液，上样pH值4.0～4.5，洗脱pH值7.0～9.0，收集洗脱峰。3)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白。本发明专利技术的特色在于开发了一种新的分离工艺，可以从酵母发酵液中直接分离得到高纯度的人血白蛋白。方法的关键在于采用了以色氨酸为配基的混合模式介质，酵母发酵液无需调整离子强度，酸性条件下吸附，中性和弱碱性洗脱，具有洗脱条件温和、工艺简单、分离效率高、收率高的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法
本专利技术属于蛋白质分离
，涉及一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法。
技术介绍
人血白蛋白是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血浆蛋白60％，主要生理功能是维持血浆渗透压，结合以及运输营养物质。临床用于治疗失血性休克、创伤性休克、急性血容量减少和低白蛋白血症等。还可作为细胞培养的添加成分、药物辅剂、赋形剂等，具有广泛的应用价值。临床使用的人血白蛋白产品主要是从人源血浆中提取纯化，制备方法包括冷乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、利凡诺沉淀、辛酸盐沉淀、层析等，原料紧张，分离复杂，且不能排除病毒或其它潜在致病因子的影响。利用现代生物技术构筑表达重组人血白蛋白的酵母细胞，可避免病毒感染，解决血源供应紧张等问题，具有良好的应用前景。但是，药用人血白蛋白的纯度要求高，而酵母发酵液组分复杂，含有蛋白酶、杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及热原物质等多种杂质，必须采用多步层析方法才能去除。酵母发酵液一般pH约6.0，电导为15～25mS/cm。专利CN1127299和US5521287利用加热、稀释、调酸、阳离子交换层析、疏水作用层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、硼酸钙沉淀等步骤，得到纯度较高的人血白蛋白。专利US5962649用阳离子交换扩张床吸附替代阳离子交换层析，缩短了工艺。不过，以上两种方法均采用阳离子交换层析捕获人血白蛋白，分离选择性有限，同时料液需要稀释处理，使得目标物浓度下降，吸附容量降低，处理量增大，过程时间延长。专利CN1854155公开了一种CaptoMMC介质在酸性条件下捕获人血白蛋白，高盐淋洗去除杂质，中性且加盐条件下洗脱得到人血白蛋白，该方法得到的白蛋白收率为65.7％。专利CN101768206A中保持专利CN1854155的上样和洗脱工艺不变，去除中间淋洗步骤，得到人血白蛋白纯度为92％，收率为71.3％。专利CN101260145也公布采用CaptoMMC分离重组人血白蛋白及其融合蛋白的层析纯化工艺，收率和纯度均为80％以上。上述基于CaptoMMC的专利存在相似问题，纯度和收率普遍较低，部分工艺需要高盐淋洗去除杂质吸附，过程复杂。针对酵母发酵液的特点，提高人血白蛋白的捕获效率，开发一种高选择性、具有耐盐特性、收率高、过程简单的分离新方法，将有助于简化人血白蛋白的分离工艺，提高效率，节约成本。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用，主要是疏水和静电相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。MX-Trp-650M介质是TOSOHBIOSCIENCE公司开发的混合模式介质，以聚甲基丙烯酸酯微球为基质，色氨酸的氨基通过酰胺键偶联到基质上作为功能配基，配基结构见图1，主要用于抗体的精制纯化，如专利US0264685A1。查阅国内外专利和文献，未发现MX-Trp-650M及其类似介质用于从酵母发酵液中分离人血白蛋白本专利技术利用混合模式层析的优势，以及人血白蛋白和小分子结合的特殊性，选用以色氨酸为主要功能配基的混合模式介质，直接从酵母发酵液中捕获人血白蛋白，开发一种混合模式层析分离人血白蛋白的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，具体包括如下步骤：1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心去除酵母细胞，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min，用离心机以8000～10000rpm转速离心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；2)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～4.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以色氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；3)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；所述的含有人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母表达重组人血白蛋白的发酵液，或者酿酒酵母表达重组人血白蛋白的发酵液；所述的混合模式介质为MX-Trp-650M，或者以酰胺键偶联色氨酸氨基作为配基的层析介质；所述的平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为4.0～4.5；所述的洗脱缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或者甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值为7.0～9.0，添加0-0.6MNaCl；所述的步骤1)中调节酵母发酵液pH值和步骤3)人血白蛋白粗品溶液的pH调节所用酸溶液为乙酸或柠檬酸溶液，所用碱溶液为氢氧化钠溶液。本专利技术针对酵母发酵液组分复杂、电导较高的特点，采用混合模式介质直接处理经预处理的酵母发酵液，充分利用混合模式层析的吸附容量大、选择性好、具有耐盐特性、洗脱条件温和等优势，提高分离效率，简化分离步骤，得到一个从酵母发酵液中直接分离人血白蛋白的新方法。本专利技术的优点在于：1)采用以色氨酸为主要功能配基的混合模式介质，利用色氨酸与人血白蛋白的特异性结合，提高人血白蛋白的吸附选择性，单步层析分离纯度高达95％以上，色素去除率达90％以上；2)混合模式介质具有良好的耐盐吸附特性，料液无需调节离子强度，直接上样，简化预处理步骤，提高分离效率；3)混合模式介质的吸附容量大，上样量达到40mg/ml介质以上，过程处理量大；4)洗脱条件温和，pH中性或弱碱性条件下，利用静电排斥作用实现有效洗脱，人血白蛋白的回收率高，达到92％以上；5)工艺简单，易于放大。附图说明图1是混合模式介质的配基结构示意图。图2是本专利技术混合模式层析分离人血白蛋白的层析分离谱图。图3是本专利技术混合模式层析分离的料液和洗脱组分高效液相色谱分析图。具体实施方式本专利技术提供一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的方法。取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心澄清后，加入辛酸钠，加热，去除杂蛋白和灭活蛋白酶，离心分离，取上清液；将上清液通过混合模式层析柱进行分离，得到人血白蛋白。本专利技术方法得到的人血白蛋白纯度大于95％。从酵母发酵液中分离人血白蛋白的方法包括如下步骤：1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心去除酵母细胞，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min，用离心机以8000～10000rpm转速离心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；2)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～4.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以色氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；3)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；所述的含有人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母表达重组人血白蛋白的发酵液，或者酿酒酵母表达重组人血白蛋白的发酵液；所述的混合模式介质为MX-Trp-650M，或者以酰胺键偶联色氨酸氨基作为配基的层析介质；所述的平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为4.0～4.5；所述的洗脱缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或者甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值为7.0～9.0，添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，其特征在于包括如下步骤：1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心去除酵母细胞，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min，用离心机以8000～10000rpm转速离心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；2)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～4.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以色氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；3)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；所述的混合模式介质为MX‑Trp‑650M，或者以酰胺键偶联色氨酸氨基作为配基的层析介质；所述的平衡缓冲液pH值为4.0～4.5；所述的洗脱缓冲液pH值为7.0～9.0。

【技术特征摘要】
1.一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法，其特征在于包括如下步骤：1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，通过离心去除酵母细胞，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min，用离心机以8000～10000rpm转速离心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；2)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至4.0～4.5，用0.45μm滤膜过滤后，上样到填充有以色氨酸为配基的混合模式介质的层析柱中，平衡缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；3)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；所述的混合模式介质为MX-Trp-650M，或者以酰胺键偶联色氨酸氨基作为配基的层析介质；所述的平衡缓冲液pH值为4.0～4.5；所述的洗脱缓冲液pH值为7....

【专利技术属性】
技术研发人员：林东强，褚文宁，吴启赐，姚善泾，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33