用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α‑半乳糖苷酶A的方法技术

公开了用于以大规模产生高纯度的重组人α‑半乳糖苷酶A(rhα‑Gal A)的方法。所述方法包括如下步骤：(a)在无血清培养基中培养产生rhα‑Gal A的哺乳动物细胞，(b)收集培养物上清液，(c)使所述培养物上清液经过阴离子‑交换柱色谱，(d)经过疏水柱色谱，(e)经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，(f)经过阳离子‑交换柱色谱，(g)经过染料‑亲和柱色谱，和(h)经过凝胶过滤柱色谱，以该顺序进行。

A method for purification of recombinant human alpha galactosidase A from host cell proteins containing pollution materials

Used to produce high purity of recombinant human in large-scale alpha galactosidase A open (RH Gal A alpha) method. The method comprises the following steps: (a) in cultured mammalian cells RH alpha Gal A culture medium without serum, collect the culture supernatant (b), (c) the culture supernatant after anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography column after (d), (E) after by affinity column chromatography with solid material as the phosphate group, (f) through cation exchange chromatography (g), after dye affinity chromatography, and (H) by gel filtration column chromatography, in this order.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从包含污染宿主细胞蛋白质的材料纯化重组人α-半乳糖苷酶A的方法
本专利技术一般涉及采用宿主细胞产生人α-半乳糖苷酶A(rhα-GalA)的方法，并且涉及从包含污染宿主细胞蛋白质的材料中纯化由此产生的所述rhα-GalA的方法。更具体地，本专利技术涉及通过在无血清培养基中培养产生rhα-GalA的哺乳动物细胞来产生rhα-GalA的方法，以及，采用柱色谱(包括染料-亲和柱色谱)从培养物上清液纯化由此产生的rhα-GalA的方法，所述方法实现高产量，并且达到高纯度以允许该纯化的蛋白质作为医药药物直接使用。
技术介绍
α-半乳糖苷酶A(α-GalA)是一种溶酶体酶，其具有水解糖脂和糖蛋白的末端α-半乳糖基键的活性。三己糖神经酰胺，其包含三个己糖部分，是α-半乳糖苷酶A的底物之一，并且接受该酶在其末端己糖部分处水解。人α-GalA表达为包含429个氨基酸的前体肽，其中N末端的31个氨基酸构成信号肽。该前体经加工成成熟肽，其在移除该信号肽之后剩下的部分由398个氨基酸组成，并且，一对成熟肽分子容易形成同二聚体，只要条件允许，其即为人α-GalA的酶活形式。人α-GalA具有包含甘露糖-6-磷酸残基的寡糖链，并且能通过甘露糖-6-磷酸受体被靶向至溶酶体。法布瑞氏病是X连锁的遗传性溶酶体贮积病，其由编码α-GalA的基因的遗传异常所致。该酶活性的缺乏造成三己糖神经酰胺在多种组织中的累积，导致肾损伤、血管扩张性疣和心血管异常，包括心室扩大和二尖瓣闭锁不全。在上世纪60年代已知晓，在患有法布瑞氏病(Fabry'sdisease)的患者的组织中几乎检测不到或仅能微弱地检测到α-半乳糖苷酶A的酶活。因此，已推测编码α-GalA的基因的一些遗传异常应是法布瑞氏病的病因。基于该推测，已通过如下方式进行了针对法布瑞氏病的α-GalA替代治疗(replacementtherapy)：将从人血浆或脾提取并纯化的α-GalA输注给所述患者，获得如下证实结果：α-GalA替代治疗可降低患有法布瑞氏病的患者血液中三己糖神经酰胺的水平(见NPL1、NPL2、NPL3)。因此，人们认定了α-GalA酶替代治疗对于法布瑞氏病而言一定是具有前景的。然而，α-GalA替代治疗的实践应用受到该酶供应缺乏的高度限制。在1986年，分离了编码人α-GalA的基因(见NPL4)，进一步地，在1988年，报到了通过采用转化有人α-GalA表达载体的CHO细胞来表达并产生rhα-GalA的方法(见NPL5)。利用重组技术，这些发现使得以大规模产生人α-GalA并利用该酶作为用于法布瑞氏病的酶替代治疗的药物成为可能。还在昆虫细胞中表达了rhα-GalA(PTL1)。此外，报道了一些用于纯化rhα-GalA的方法，其包括采用疏水柱色谱、肝素琼脂糖柱色谱、羟基磷灰石柱色谱、阴离子-交换柱色谱，和凝胶过滤柱色谱(PTL2、PTL3)。尽管已显示PTL2或PTL3中所描述的用于纯化的方法获得的rhα-GalA的纯度充分地高，并不认为其能完全适用于人类应用。原因在于，待输注给患者的任何药物均必须不含污染物，具体而言，例如，源自所用宿主细胞的蛋白质，无论PTL2还是PTL3均没有显示纯化的rhα-Gal中是否余留有这样的污染物。此外，据报道，用于纯化rhα-GalA的方法包括，按顺序使用阴离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱、阳离子-交换柱色谱，和凝胶过滤柱色谱(PTL4)。然而PTL没有提及rhα-GalA的宿主细胞蛋白质污染。目前，包含rhα-GalA作为活性成分的法布瑞氏病的医药药物已在市场上以商品名例如ReplagalTM和FabrazymeTM出售。引用列表专利文献PTL1:WO90/11353PTL2:WO98/11206PTL3:WO00/53730PTL4:WO14/017088非专利文献NPL1:Mapes等:Science169:987-9(1970)NPL2:Brady等:N.Engl.J.Med.289:9-14(1973)NPL3:Desnick等:ProcNatlAcadSciUSA76:5326-30(1979).NPL4:Bishop等:ProcNatlAcadSciUSA83:4859-63(1986)NPL5:Bishop等:《脂质贮积疾病-生物学与医学方面》(LipidStorageDisorders-BiologicalandMedicalAspects)，纽约普莱纽姆出版社(NYPlenumPress)P809-823(1988)
技术实现思路
技术问题针对上述背景，本专利技术的一个目的在于：提供以在无血清培养基中培养产生rhα-GalA的哺乳动物细胞开始的，产生和纯化重组人α-半乳糖苷酶A(rhα-GalA)的方法。本专利技术的另一个目的在于，提供用于从包含污染物宿主细胞蛋白质的培养物上清液纯化rhα-GalA的方法，通过包括染料-亲和柱色谱的柱色谱，以实现高产量，并且达到高纯度以允许该纯化的蛋白质作为医药药物直接使用。解决技术问题所采用的技术方案本专利技术的专利技术人发现，在无血清培养基中培养产生rhα-GalA的细胞的上清液中所含的rhα-GalA，可从包含污染宿主细胞蛋白质的该上清液纯化至极高纯度，并且同时获得极高的产量，通过使rhα-GalA经过包括阴离子-交换柱色谱、疏水柱色谱、采用对磷酸基团具有亲和性的柱的色谱、阳离子-交换柱色谱、染料-亲和柱色谱，和凝胶过滤柱色谱的组合的纯化方法来实现。本专利技术通过基于该发现做出进一步研究而完成。因此，本专利技术提供如下内容：1.用于产生重组人α-GalA的方法，其包括如下步骤：(a)在无血清培养基中培养产生重组人α-GalA的哺乳动物细胞，以让其在该培养基中分泌重组人α-GalA，(b)通过从在上述步骤(a)中获得的培养物去除细胞来收集培养物上清液，(c)使在上述步骤(b)中收集的培养物上清液经过阴离子-交换柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(d)使在上述步骤(c)中收集的该分级分离部分经过疏水柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(e)使在上述步骤(d)中收集的该分级分离部分经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(f)使在上述步骤(e)中收集的该分级分离部分经过阳离子-交换柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(g)使在上述步骤(f)中收集的该分级分离部分经过染料-亲和柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，和(h)使在上述步骤(g)中收集的该分级分离部分经过凝胶过滤柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，以所述顺序进行。2.如上述(1)所述的方法，其中，阳离子-交换柱色谱中所用的阳离子交换器是弱阳离子交换器。3.如上述(2)所述的方法，其中，所述弱阳离子交换器具有基于疏水相互作用和氢键形成的选择性。4.如上述(2)或(3)所述的方法，其中，弱阳离子交换器具有苯基基团、酰胺键和羧基基团。5.如上述(1)-(4)之一所述的方法，其中，所述染料-亲和柱色谱中所用的染料是蓝色三嗪染料。6.如上述(1)-(5)之一所述的方法，其中，所述对本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生重组人α‑Gal A的方法，包括如下步骤：(a)在无血清培养基中培养产生重组人α‑Gal A的哺乳动物细胞，以让其在该培养基中分泌重组人α‑Gal A，(b)通过从在上述步骤(a)中获得的培养物去除细胞来收集培养物上清液，(c)使在上述步骤(b)中收集的培养物上清液经过阴离子‑交换柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，(d)使在上述步骤(c)中收集的该分级分离部分经过疏水柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，(e)使在上述步骤(d)中收集的该分级分离部分经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，(f)使在上述步骤(e)中收集的该分级分离部分经过阳离子‑交换柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，(g)使在上述步骤(f)中收集的该分级分离部分经过染料‑亲和柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，和(h)使在上述步骤(g)中收集的该分级分离部分经过凝胶过滤柱色谱，以收集重组人α‑Gal A‑活性分级分离部分，以所述顺序进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.22 JP PCT/JP2015/0002901.用于产生重组人α-GalA的方法，包括如下步骤：(a)在无血清培养基中培养产生重组人α-GalA的哺乳动物细胞，以让其在该培养基中分泌重组人α-GalA，(b)通过从在上述步骤(a)中获得的培养物去除细胞来收集培养物上清液，(c)使在上述步骤(b)中收集的培养物上清液经过阴离子-交换柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(d)使在上述步骤(c)中收集的该分级分离部分经过疏水柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(e)使在上述步骤(d)中收集的该分级分离部分经过采用对磷酸基团具有亲和性的材料作为固相的柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(f)使在上述步骤(e)中收集的该分级分离部分经过阳离子-交换柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，(g)使在上述步骤(f)中收集的该分级分离部分经过染料-亲和柱色谱，以收集重组人α-GalA-活性分级分离部分，和(h)使在上述步骤(g)中收集的该分级分离部分经过凝胶...

【专利技术属性】
技术研发人员：福井刚，川崎敦子，秦野勇吉，伊藤八重，三原和敏，杉村厚，
申请(专利权)人：JCR制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本,JP