一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法技术

本发明专利技术涉及微生物菌株筛选技术领域，具体涉及一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。本发明专利技术通过制备绿色产色链霉菌原生质体，采用ARTR系统对原生质体进行诱变，结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及阿维拉霉素A组分含量为指标进行筛选，筛选得到的菌株具有发酵稳定性高，阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高的优点。本发明专利技术降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法
本专利技术涉及微生物菌株筛选
，具体涉及一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。
技术介绍
阿维拉霉素(Avilamycin)又称为卑霉素，可通过与肠道内异生的革兰氏阳性菌的核糖体结合，抑制相关蛋白的合成，从而维持整体益生菌群的生态平衡，同时还可通过抑制肠道微生物乳酸的产生，从而减少肠道蠕动，延迟营养物质在动物肠道的停留时间，起到促进消化与调节代谢的作用，从而促进动物生长。阿维拉霉素由于其独特的结构、安全性高、易降解、基本无残留、促生长及抗病等特性在动物饲料特别是猪和肉鸡饲料当中得以广泛应用。绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogene)是阿维拉霉素的产生菌。目前，全球阿维拉霉素的生产被美国礼来公司垄断，其首先开发并进行销售的10％预混剂类型,已在世界40多个国家登记上市。并且我国也在本世纪初将其引入，商品名为“效美素”(MAXUS)，而且目前礼来已经申请到阿维拉霉素20％预混剂，在饲料行业限抗的今天，其市场前景非常看好。2005年前后，国内开始有对阿维拉霉素菌株的选育及发酵条件的研究报道，然而，相关的研究尚处于初级阶段，产素水平较低，而且发酵中杂质成分多，进而对后续分离纯化带来困难，增加生产成本，究其原因，还是菌株的发酵水平不行。如何获得高效积累有效成分的优良菌株成为开发改产品的关键技术瓶颈。ARTP(atmosphericandroomtemperatureplasma，ARTP)诱变技术是指在常温常压环境下通过产生高活性的等离子体射流，致使细胞受到多样性的损伤，从而起到基因突变的效果。ARTP生物育种技术正以其操作的简便性、安全无毒性和高效性等特点得到了广泛认可，并且在微生物育种领域的发挥着重要作用。S.viridochromogene作为一类放线菌，呈菌丝状生长，并且以孢子繁殖，而且具有细胞壁，直接诱变处理，往往处理效果不好，而且会由于菌丝分散不均匀，导致诱变处理效果不佳，另外，孢子的特殊结构往往使得其对诱变剂不敏感，会形成很多的假阳性效果。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法。本专利技术首先制备绿色产色链霉菌原生质体，采用ARTR系统对原生质体进行诱变，结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及阿维拉霉素A组分含量为指标进行筛选，筛选得到的菌株具有发酵稳定性高，阿维拉霉素产量高，而且有效组分含量高的优点。本专利技术降低了制备相关产品的成本，显示了非常好的工业化应用潜力。本专利技术通过以下技术方案实现：一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：S1.取活化培养好的绿色产色链霉菌斜面一支，作为出发菌株，加入4～6mL无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％～6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50mL种子培养基的250mL带挡板三角摇瓶，27～29℃，210～230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000～7000rpm，4℃离心5～10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；S2.以SMM溶液作为渗透压稳定剂，在步骤S1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mgmL-1～15mgmL-1溶壁酶5mL，30℃条件下分别酶解45min～75min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用SMM溶液洗涤离心两次，最后用3mL的SMM溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；S3.将步骤S2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行ARTP诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115W，通气量为10Lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为1～3mm，处理30～50s；S4.将步骤S3ARTP诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，27～29℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，同挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；S5.将步骤S4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，27～29℃，210～230rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10mL发酵液至10mL离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100mL容量瓶中，40Khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用HPLC法检测阿维拉霉素A的含量，挑选出抑菌效价高，阿维拉霉素A的产量高的菌株。优选地，步骤S1中所述种子培养基配方及浓度为：可溶性淀粉20.0g/L，豆粕提取粉8.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，D-木糖7.5g/L，CaCO30.5g/L，FeSO40.01g/L，MgSO40.5g/L，MnCl20.5g/L，NaOH调节pH7.2-7.5。优选地，步骤S1中所述磷酸高渗缓冲液由0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液中加入终浓度为0.8mol/L甘露醇制备而成。优选地，步骤S2中所述SMM缓冲液由以下成分及含量组成：0.5mol/L蔗糖、20mol/LMgC12、0.02mol/L顺丁烯二酸钠盐，NaOH调pH6.5。优选地，步骤S2中加入12mgmL-1溶壁酶5mL，30℃条件下酶解60min。优选地，步骤S3中ARTP诱变处理时间为40s。优选地，步骤S3再生平板中所用再生培养基为：可溶性淀粉20.0g/L，MgSO40.35g/L，KNO31.2g/L，K2HPO40.25g/L，KH2PO40.55g/L，FeSO40.01g/L，NaCl0.5g/L，琼脂粉20.0g/L和110g/L的蔗糖，NaOH调节pH7.2-7.5。优选地，步骤S4中所用检菌为藤黄微球菌。优选地，步骤S5中发酵所用培养基为：可溶性淀粉20.0g/L，豆粕提取粉8.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，D-木糖7.5g/L，L-缬氨酸3.0g/L，CaCO30.5g/L，FeSO40.01g/L，MgSO40.5g/L，MnCl20.5g/L，NaOH调节pH7.2-7.5。本专利技术以活化斜面孢子悬液接种的摇瓶种子培养24h后获得的菌体作为出发菌丝体，采用高效溶壁酶为去壁酶，最佳酶浓度为12mgmL-1，最佳酶解时间为60min，所得的原生质体数不仅较多，而且质量最好，再生率最高。为获得更多的细胞损伤，最大限度的获得突变菌株库，以制备的S.viridochromogeneAVL4原生质体为研究对象，采用ARTP诱变系统对其进行诱变处理，在综合考虑致死率及菌落数的条件下，选择最佳的处理时间40s，并结合诱变菌株的形态特征和菌落抑菌生物效价进行初筛，获得生物抑菌效价显著提高的正突变株，然后通过摇瓶复筛，以阿维拉霉素抑菌效价及有效成分——阿维拉霉素A组分含量为指标，获得抑菌效价最高，且阿维拉霉素A组分含量最高的菌株。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)筛选得到的突变株摇瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取活化培养好的绿色产色链霉菌斜面一支，作为出发菌株，加入4～6mL无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％～6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50mL种子培养基的250mL带挡板三角摇瓶，27～29℃，210～230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000～7000rpm，4℃离心5～10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；S2.以SMM溶液作为渗透压稳定剂，在步骤S1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mg mL

【技术特征摘要】
1.一种阿维拉霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.取活化培养好的绿色产色链霉菌斜面一支，作为出发菌株，加入4～6mL无菌生理盐水洗脱，制备孢子悬液，并按4％～6％的接种量转入含5％甘氨酸的装有50mL种子培养基的250mL带挡板三角摇瓶，27～29℃，210～230rpm继续培养24h，培养结束后，将菌液5000～7000rpm，4℃离心5～10min，磷酸高渗缓冲液清洗两次，弃去上清，得到原生质体制备的出发菌丝体；S2.以SMM溶液作为渗透压稳定剂，在步骤S1制备的出发菌丝体管中加入终浓度为9mgmL-1～15mgmL-1溶壁酶5mL，30℃条件下分别酶解45min～75min，温育结束后，采用无菌脱脂棉过滤除去未酶解的菌丝，收集滤液，4℃，2000rpm离心10min，弃上清，然后再用SMM溶液洗涤离心两次，最后用3mL的SMM溶液重悬细胞，得到原生质体悬液；S3.将步骤S2原生质体悬液置于无菌的试管中，进行ARTP诱变：预设以氦气作为工作载气，设定功率为115W，通气量为10Lmin-1，等离子发射源与样品之间的距离为1～3mm，处理30～50s；S4.将步骤S3ARTP诱变处理后的原生质体涂布于再生平板并置于28℃恒温培养箱培养3天，选择菌落大小、形状、外观形态发生变化的单菌落转接至另外的固体平板，27～29℃继续恒温培养2天，培养结束后采用灭过菌的的打孔器将单个菌落打下，并置于无菌湿润的无菌小盘中继续培养3天，至菌丝长满培养基表面；然后取菌落小块置于含有1％的检菌的琼脂平板上，37℃培养24h后观察并测定琼脂块抑菌圈大小，挑选抑菌圈比出发菌株大的菌株；S5.将步骤S4筛选获得的菌落从斜面接种至种子摇瓶，然后再转接发酵摇瓶，27～29℃，210～230rpm，振荡培养72h，收集发酵液；取10mL发酵液至10mL离心管中，6000×g离心10min，弃上清，甲醇重悬后转移至100mL容量瓶中，40Khz频率超声40min，冷却，甲醇定容，0.45μm过滤膜过滤，进行生物抑菌效价检测，同时采用HPLC法检测阿维拉霉素A的含量，挑选出...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋顺进，刘宗新，郑雪媚，黄炜乾，唐谢芳，
申请(专利权)人：广东容大生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44