一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法，基于抗原蛋白自组装制备而成，在疫苗制备过程中选择性引入分子佐剂，抗原含量≥85％，无需铝佐剂、弗氏佐剂等辅助即可引发高效免疫效应，利用物理调控暴露蛋白分子间的巯基，通过巯基/二硫键交换反应，形成以二硫键交联为主的稳定的蛋白纳米粒。本发明专利技术克服了传统纳米疫苗需引入外源载体或交联剂等缺陷，可同时提高疫苗的免疫效应及生物安全性。所得到的疫苗颗粒形貌规整，稳定性强，调控方式灵活，重复性好，可高效刺激树突细胞成熟。具有较强的通用性、普适性，在一系列的抗原蛋白上得到验证，在疫苗新方法及生物制药领域具有潜在重大应用价值。

Novel self assembled nano vaccine of protein and preparation method thereof

The invention relates to a novel nano self-assembled protein vaccine and preparation method, based on antigen protein self-assembly process, in the process of preparing vaccines into selective molecular adjuvant and antigen content is more than 85%, without aluminum adjuvant, Freund's adjuvant adjuvant can lead to efficient immune effect, the use of physical control exposed sulfhydryl protein between molecules, through two thiol / disulfide exchange reactions, to form two disulfide cross-linking based stable protein nanoparticles. The invention overcomes the defects that the traditional nano vaccine needs to introduce exogenous carrier or cross linking agent, and can simultaneously improve the immune effect and biological safety of the vaccine. The obtained vaccine particles have regular appearance, strong stability, flexible control mode and good repeatability, and can effectively stimulate the maturation of dendritic cells. With strong versatility and universality, it has been validated on a series of antigen proteins, and has potential applications in the new vaccine and biopharmaceutical industry.

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法
本专利技术属于高分子纳米生物医药材料领域，尤其是涉及一种蛋白自组装新型纳米疫苗及其制备方法，基于大分子抗原蛋白分子调控，通过内部巯基交联、蛋白再折叠或自组装的方法将抗原肽或免疫佐剂载入蛋白，形成高密度纳米疫苗。
技术介绍
疫苗保护人类免受诸多致命性疾病的侵袭，是人类历史上最成功的医疗措施，如在全世界范围内根除了天花并且有效地减少了其它一些烈性的传染病感染，例如：脊髓灰质炎、白喉、破伤风、百日咳、麻疹、腮腺炎以及风疹病毒的感染等，在改善了人类的生活质量的同时，更是大大延长了人类的平均寿命。根据美国国立卫生研究院2010年的统计数据显示，疫苗每年至少减少了250万例死亡与难以计数的其他病例。传统的疫苗设计采用病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、脱毒、灭活等方法制成疫苗，其缺点在于如果病原体灭活不彻底，会导致生物安全风险。当前的传统疫苗主要是指灭活苗和弱毒苗，但也存在着很难解决的弊端。如，常规疫苗生产成本高，需要佐剂和多种免疫接种方式才能引起有效地免疫保护，并且容易受到母源抗体的干扰，而对新生幼畜具有很低或没有免疫保护作用。类毒素可以引起体液免疫应答但是不产生或产生很少的细胞免疫应答；灭活苗中不能引起免疫应答的部分不仅对预防传染没有作用，反而有可能减弱能引起免疫反应部分产生的免疫保护作用。灭活苗中还含有对机体有害的物质，例如，内毒素等。活疫苗存在致病力并且有污染的风险，一般说来，灭活苗安全但和活疫苗相比其产生免疫保护的时间短并且保护力弱。而活疫苗中存在致病毒株和其它病原体的风险非常高。弱毒疫苗既可以产生体液免疫又能产生细胞免疫，但是弱毒疫苗仅适用于少数病原和免疫力低下的动物。亚单位疫苗是利用微生物表面的一种或多种保护性抗原诱发机体产生保护性免疫应答，但亚单位疫苗通常免疫原性较弱，需要添加佐剂来增强免疫原性，例如经FDA批准的铝佐剂及弗氏佐剂。但是，已有许多人对铝佐剂的安全及质量问题提出了质疑，如：铝佐剂不能冻干，制备的疫苗批与批之间差异大，质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价；主要刺激Th2相关抗体的产生，只能诱导产生体液免疫应答；增加发生超敏反应的危险。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防或治疗疾病目的。有案可查的动物用DNA疫苗包括：马西尼罗病毒疫苗、人用HIVDNA疫苗等。由于DNA疫苗可能存在与机体细胞基因组DNA发生整合的担忧，一些疫苗学家可能对其应用于人体持谨慎态度。纳米疫苗作为一种新型纳米疫苗，是目前疫苗领域的一大热点。纳米颗粒作为抗原与佐剂的递送工具和免疫增强剂被广泛应用，不仅提高了抗原、佐剂的稳定性，增强抗原的递呈效率和免疫原性，促进抗原胞内加工，可与主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)分子特异性结合；同时也能够靶向递呈抗原，具有缓释功能；重要的是，许多纳米颗粒自身具有免疫佐剂活性，可高效增强机体免疫应答。然而，纳米载体如纳米乳剂、脂质体、胶束、PLGA、硅纳米粒、金纳米棒等，也带来了很多问题，如抗原与佐剂负载效率低、载体在疫苗组分中占比过高；抗原与佐剂的颗粒内包封使得抗原的表面多展示近似于无；动物或人体内产生了针对纳米颗粒的抗体，例如PEG是获得公认的生物相容性良好的生物材料，但却被发现机体内产生了针对PEG的抗体；纳米载体的毒性与体内代谢问题也没有得到很好的解决。重要的是，传统的疫苗偏重于疾病的预防，在转向至免疫治疗时往往效果不佳，而对已发病的个体则不能诱发免疫应答，也无法抵御疾病的发生。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于抗原内部二硫键自纳米化交联的、全抗原新型自纳米化纳米疫苗及其制备方法，该纳米粒子能有效解决现有疫苗技术合成成本高、合成过程复杂、涉及生物安全性等问题，也有效解决了现有纳米疫苗设计领域使用外源载体、化学交联剂及抗原密度低、无抗原表面展示等传统问题，并且结构稳定、易于储存、具有高度模拟病毒结构的特点，实现了载体即抗原，同时纳米颗粒又具有免疫佐剂的双重作用。该纳米疫苗可高效促进免疫细胞对抗原的吞噬，无细胞毒性，具有良好的生物相容性，可高效刺激树突细胞成熟、产生免疫反应。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：新型自纳米化纳米疫苗，仅包括抗原蛋白与免疫佐剂。所述的抗原包括，病毒抗原、细菌抗原以及肿瘤抗原，来自于病毒、细菌、其他微生物、肿瘤或基因工程蛋白产物，所述的免疫佐剂包括，所述免疫佐剂为Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子佐剂、DNA类免疫佐剂、皂苷类佐剂、多肽类佐剂及抗原肽、多糖类佐剂、无机纳米佐剂、有机纳米佐剂、化疗药或它们的组合。本专利技术的技术方案为：一种制备具有抗原高密度的新型自纳米化纳米疫苗的方法，包括以下步骤：(a)用一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液；(b)在变性剂或者适合的变性条件中将免疫佐剂或其它物质加入步骤(a)中所述的蛋白溶液中，使蛋白去折叠以巯基暴露，通过二硫键交联以及蛋白再折叠或自组装，把免疫佐剂或多肽包入蛋白，形成蛋白纳米颗粒；(c)将合成的纳米疫苗快速冷却，以停止反应；(d)形成的纳米疫苗溶液可通过简单的物理方法去除体系无用的小分子成分，提纯或浓缩，得到新型自纳米化纳米疫苗。所述的这些抗原是这样的抗原，已经被使用或者可用于治疗或预防易于影响动物界以及人的多种疾病，尤其为：白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whoopingcough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitisA，BorC)、黄热病(yellowfever)、伤寒(typhoidfever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(Germanmeasles)、乙型脑炎(Japaneseencephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)、霍乱(cholera)；由以下病毒介导的传染：轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus)、单纯疱疫病毒(HerpesSimplexVirus)、乳头状瘤病毒(PapillomaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(WestNileVirus)、登革热病毒(DengueVirus)、基孔肯雅病毒(ChikungunyaVirus)、HIV(AIDS)；由以下引起的细菌性疾病：链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatisandpneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenzatypeB)，李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’sdisease)、寄本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗仅包含抗原蛋白和免疫佐剂或抗原肽，由自体内部的巯基通过巯基/二硫键反应形成以二硫键为主，以疏水作用力、氢键、静电作用力弱相互作用力为辅，将免疫佐剂及抗原肽包封在形成的纳米颗粒中。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗仅包含抗原蛋白和免疫佐剂或抗原肽，由自体内部的巯基通过巯基/二硫键反应形成以二硫键为主，以疏水作用力、氢键、静电作用力弱相互作用力为辅，将免疫佐剂及抗原肽包封在形成的纳米颗粒中。2.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗的抗原蛋白质量占比≥85％，免疫佐剂或抗原肽占比≤15％。3.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗不使用化学交联剂和纳米载体。4.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗的平均粒径在20-500nm。5.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，该疫苗具有还原敏感性。6.根据权利要求1或2所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，所述的抗原蛋白为含有半胱氨酸和/或二硫键的蛋白质，优选含有半胱氨酸和/或含≥3个二硫键的抗原蛋白。7.根据权利要求6所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，所述的抗原蛋白包含如下结构中的一种：白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whoopingcough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitisA，BorC)、黄热病(yellowfever)、伤寒(typhoidfever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(Germanmeasles)、乙型脑炎(Japaneseencephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)或霍乱(cholera)；由以下病毒介导的传染：轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus)、单纯疱疫病毒(HerpesSimplexVirus)、乳头状瘤病毒(PapillomaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(WestNileVirus)、登革热病毒(DengueVirus)、基孔肯雅病毒(ChikungunyaVirus)或HIV(AIDS)；由以下引起的细菌性疾病：链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体(trachomatisandpneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌或B型流感嗜血菌influenzatypeB)，李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme’sdisease)、寄生虫疾病(parasiticcomplaints)诸如痕疾(malaria)或利什曼病(leishmaniosis)；各种肿瘤抗原、肿瘤裂解物或肿瘤模式抗原OVA；或者来自于免疫原性较弱的蛋白，包括血清白蛋白、乳白蛋白、肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、血管内皮抑素、血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维连接蛋白、纤层蛋白、胶原蛋白、明胶、人造多肽与蛋白，或者它们的组合。8.根据权利要求1或2所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，所述的免疫佐为剂Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子佐剂、DNA类免疫佐剂、皂苷类佐剂、多肽类佐剂及抗原肽、多糖类佐剂、无机纳米佐剂、有机纳米佐剂、化疗药或它们的组合。9.根据权利要求8所述的一种蛋白自组装新型纳米疫苗，其特征在于，所述的Toll样受体激动剂为CpGODN、poly(I:C)或肽聚糖；所述的NOD样受体激动剂为γ-D-谷氨酸-meso-二氨基庚二酸(γ-D-glu-meso-DAP)，或NOD2识别的配体胞壁酸二肽(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺，MDP)；所述的细胞因子佐剂为白细胞介素-12、干扰素-γ或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；所述的DNA类免疫佐剂是编码细胞因子(白细胞介素类、干扰素类、肿瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永勇，王坤，任天斌，温姝曼，董海青，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海,31