一种胰岛素类似物及其合成方法技术

本发明专利技术公开了一种胰岛素类似物，其A链和B链序列及结构如下：

Insulin analog and synthetic method thereof

The invention discloses an insulin analog, whose A chain and B chain sequence and structure are as follows:

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素类似物及其合成方法
本专利技术涉及蛋白质多肽领域，具体地说涉及一种胰岛素类似物及其合成方法。
技术介绍
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。显微镜下的胰岛β细胞显微镜下的胰岛β细胞。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。中国科学院肾病检测研究所主治直至80年代初，用于临床的胰岛素几乎都是从猪、牛胰脏中提取的，这就是第一代胰岛素-动物胰岛素。不同动物的胰岛素组成均有所差异，猪的与人的胰岛素结构最为相似，只有B链羧基端的一个氨基酸不同。动物胰岛素是最早应用于糖尿病治疗的胰岛素注射制剂一般是猪胰岛素，猪胰岛素与人胰岛素存在1至4个氨基酸的不同，因此容易发生免疫反应，注射部位皮下脂肪萎缩或增生，胰岛素过敏反应，并且由于其免疫原性高，容易反复发生高血糖和低血糖，容易出现胰岛素抵抗。80年代初已成功地运用遗传工程技术由微生物大量生产人的胰岛素，并已用于临床，这就是第二代胰岛素-人胰岛素。虽然人胰岛素相比于动物胰岛素有很多优点，但是，在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。20世纪90年代末，在对人胰岛素结构和成分的深入研究中发现，对肽链进行修饰：利用基因工程技术，改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合；改变等电点；增加六聚体强度；以钴离子替代锌离子；在分子中增加脂肪酸链，加大与白蛋白的结合，均有可能改变其理化和生物学特征，从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)，也就是第三代胰岛素。胰岛素类似物可紧临餐使用，也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种稳定性高的胰岛素类似物。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种胰岛素类似物，其A链和B链序列及结构如下：本专利技术还提供上述胰岛素类似物的合成方法，包括以下步骤：采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照权利要求1所示的序列分别将A链和B链氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中A链第11位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，待A链第11位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至A链第7位，待A链第7位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令A链第11位二氨基二酸构件单元与A链第7位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合A链第5位以及余下的氨基酸；最后经切割液处理以及连接后，获得所述胰岛素类似物；进一步地，合成A链所用的树脂为RinkAMamideresin，合成B链所用的树脂为2-Cl-Trt-Cl-resin。进一步地，所述缩合剂选自HATU、HOAT、PyAOP中的任意一种或任意几种。进一步地，合成温度为25℃。进一步地，A链第21位氨基酸为Fmoc-Asp-OtBu、第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH；B链第7位氨基酸为Fmoc-Cys(Acm)-OH。进一步地，Alloc保护基团的脱除试剂为四(三苯基膦)钯与苯硅烷的混合物。进一步地，Fmoc保护基团的脱除试剂为含有20vt％哌啶的DMF溶液。进一步地，A链所用的切割液为三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液；B链所用的切割液为三氟乙酸、水、TIPS、DTNP的混合液。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术胰岛素类似物具有非常稳定的结构，通过在肽片段的合成中引入S-C键替换容易断裂S-S键，不仅可以起到稳固蛋白空间构象的作用，也可以促进复性过程的剩余二硫键的配对提高整体复性效率。另外本专利技术方法操作简便，收率高，获得的胰岛素类似物具有更好的稳定性。附图说明图1是本专利技术胰岛素类似物的A链HPLC色谱图。图2是本专利技术胰岛素类似物的B链HPLC色谱图。图3是本专利技术胰岛素类似物的A链和B链两步连接反应HPLC色谱图。图4是本专利技术胰岛素类似物的A链和B链第一步连接产物HPLC色谱图。图5是本专利技术胰岛素类似物的A链和B链最终连接产物HPLC色谱图。图6是本专利技术胰岛素类似物的A链质谱图。图7是本专利技术胰岛素类似物的B链质谱图。图8是本专利技术胰岛素类似物的A链和B链第一步连接产物质谱图。图9是本专利技术胰岛素类似物的A链和B链最终连接产物质谱图。图10是本专利技术胰岛素类似物与天然胰岛素的稳定性比较图。具体实施方式下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。实施例1二氨基二酸构件单元的制备反应式为：具体步骤为：化合物2：取6.01mg(25.0mmol)胱氨酸溶于10mL70％高氯酸中，然后缓慢加入62.5mL乙酸叔丁酯。反应过夜。反应结束后，加入水50mL，并将反应冰浴降温。监测反应结束后，用10M氢氧化钠调节反应体系的pH到10，然后使用乙酸乙酯萃取有机相，再使用无水硫酸钠干燥，最后将有机溶剂旋转蒸发，得到白色颜色固体粉末。将固体粉末溶解于85mL四氢呋喃中，加入3.85mL(34.9mmol)N-甲基吗啉。将反应体系置于冰水中降温处理，缓慢加入11.75g(34.9mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)。反应恢复至室温过夜。结束反应后，首先使用旋转蒸发仪旋除溶剂，然后加入乙酸乙酯，并用水和饱和食盐水清洗，再用无水硫酸钠干燥有机相，然后使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，并使用硅胶柱分离纯化。洗脱剂为7：3的正己烷：乙酸乙酯，得到10.69g(13.4mmol)白色固体产物2，产率为79％。比移值0.55(2：1的正己烷：乙酸乙酯)。化合物3：在氮气保护下将产物2溶解于45mL四氢呋喃溶液中,然后加入1.37mL(5.5mmol)三丁基膦。反应30分钟后，加入4.5mL水，反应过夜处理。反应结束后使用旋转蒸发仪旋除溶剂，再加入40mL*3乙酸乙酯，并用10％的柠檬酸和饱和食盐水分别清洗有机相，最后使用无水硫酸钠干燥后旋除溶剂。粗产品使用硅胶柱纯化，洗脱剂为4:1的正己烷:乙酸乙酯，得到2.53g(6.33mmol)的无色油状产物3，产率为86％。比移值0.45(4:1的正己烷:乙酸乙酯)。化合物4：称取1.01g(8.48mmol)高丝氨酸和0.90g(8.48mmol)碳酸氢钠在氮气保护下溶解于10mL水和5mL乙腈中，使用冰浴冷却反应体系。再缓慢加入0.9mL(8.48mmol)氯甲酸烯丙酯。等反应体系恢复室温继续反应过夜。反应结束后旋除溶剂，得到的粗产品无需后处理纯化。将粗产品溶解于DMF中，随后加入0.71g(8.48mmol)的碳酸钠，缓慢加入0.81mL(9.33mmol)的烯丙基溴，反应过夜。反应结束后使用乙酸乙酯萃取有机相，并使用水和饱和食盐水清洗有机相，最后旋除有机相，并使用硅胶柱纯化产物，洗脱剂1:1的正己烷:乙酸乙酯。比移值为0.39(1:1的正己烷:乙酸乙酯)。得到1.58g(6.50mmol)的无色油状产物4，产率为77％。化合物5：在氮气保护下取4.00g(16.4mmol)化合物4和6.53g(19.7mm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素类似物，其特征在于，其A链和B链序列及结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素类似物，其特征在于，其A链和B链序列及结构如下：2.如权利要求1所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：采用Fmoc固相合成法，以树脂作为固相载体，经缩合剂活化，按照权利要求1所示的序列分别将A链和B链氨基酸由C端向N端逐个偶联到树脂上，且其中A链第11位Cys由式1所示的二氨基二酸构件单元所替换，待A链第11位二氨基二酸构件单元耦合完后，由C端向N端继续耦合直至A链第7位，待A链第7位耦合完后，先脱除Alloc保护基团和Fmoc保护基团，再令A链第11位二氨基二酸构件单元与A链第7位氨基酸进行缩合成环，最后继续耦合A链第5位以及余下的氨基酸；最后经切割液处理以及连接后，获得所述胰岛素类似物；3.如权利要求2所述的胰岛素类似物的合成方法，其特征在于，合成A链所用的树脂为RinkAMamideresin，合成B链所用的树脂为2-Cl-Trt-Cl-resin。4.如权利要求2或3所述的胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：田长麟，张隆华，黄栋梁，郭晓奇，周莉，
申请(专利权)人：中国科学技术大学先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34