胰岛素类似物的制备方法技术

本发明专利技术提供了新的速效人胰岛素类似物，其自身结合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的倾向较小。该新的人胰岛素类似物是通过用天然存在的氨基酸残基取代人胰岛素中的一个或多个氨基酸残基的方法得到的。氨基酸残基取代基最好比分子的相应位置上的天然氨基酸残基更亲水。另外，该胰岛素类似物在中性ｐＨ值时与人胰岛素相比，具有相同或更大的负电性。氨基酸取代基以天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸和异亮氨酸为好，向更好的取代基是天冬氨酸和谷氨酸。该新的胰岛素类似物可以用于速效胰岛素溶液的制备。（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一种以皮下注射后立即产生作用为特征的新型人类胰岛素类似物，含有这种胰岛素类似物的胰岛素注射液和制备这种胰岛素类似物的方法。在治疗糖尿病中，技术人员已提出许多种胰岛素配制品，其中一些是速效的，而另外一些或多或少有延迟作用。在急症情况下，像高血糖昏迷，外科手术、怀孕期间和严重感染时可以使用速效胰岛素制剂。此外，每天多次注射速效胰岛素制剂可改进那些已表明是难以用长效胰岛素控制的糖尿病人的病情控制。最近几年，对一个用胰岛素治疗方法产生了愈来愈大的兴趣，该方法研究了健康组织的β细胞中胰岛素的分泌，即，与餐食相联系地补充胰岛素，並维持一个基本的胰岛素水平。临床观察表明糖尿病患者借助于每天一次注射长效胰岛素以满足基本的需要，並在主餐之前补充注射少量的速效胰岛素就能够获得接近于正常的胰岛素和葡萄糖浓度。在治疗既需要中效和长效胰岛素的推迟作用，又需要较强的起始效应的糖尿病患者时，还可以将速效胰岛素与中效和长效胰岛素混合使用。最后，速效胰岛素可应用在连续的胰岛素输送系统中。皮下注射速效胰岛素溶液，已观察到吸收时有一个初始延迟(Binder，Diabetes Care 7.NO.2(1984)，188-199)，然而，当目标是严格的代谢控制时，这种由较慢开始作用引起的延迟吸收是不希望的。将速效胰岛素溶液与长效胰岛素制剂混合还会进一步使速效胰岛素的吸收速率降低。因此，需要有一种皮下注射后较快发生作用的、並且改进与长效胰岛素制剂的混溶性的速效胰岛素溶液。已知的速效胰岛素溶液的另一个缺点是在用于连续输注胰岛素的胰岛素溶液中，胰岛素有形成微纤维並从该溶液中沉淀出来的趋势，因而阻塞了机械部件和输送导管。最后，还需要另一种治疗对正常胰岛素具有耐受性的病人用的胰岛素制剂。本专利技术的目的是提供一种具有以下一种或多种改进特性的新型速效胰岛素溶液。1)通过皮下注射或其他给药途径，能较快发生作用。2)改进了与延迟胰岛素配制品的混溶性。3)降低了在用于可植入的输送系统时产生微纤微的趋势。4)适用于耐药性病人的治疗(对先前存在的抗体具有低的亲和性)。用下文描述的新型可注射的人胰岛素类似物的水溶液可达到本专利技术的目的。过去已介绍过大量的胰岛素类似物，Marki等人(Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem，360(1979)，1619-1632)介绍了人胰岛素类似物的合成，这些胰岛素类似物在A链的2，5，6，7，8和11位，和B链的5，7，13和16位中单氨基酸的取代上不同于人胰岛素。从而对颇感兴趣的胰岛素的结构与活性的关系有了深入了解。其他研究改进了胰岛素(B(22)-β(26))内主要受体的结合区域，以了解这种变异对受体结合活性的影响。然而，已知的人胰岛素类似物不能呈现出本专利技术人所要求的这些性质。众所周知，硫酸盐化的胰岛素形成微纤维的趋势较低(Albisser等人，用于输注泵的胰岛素的理想特性，InGueriguian J.L等人，eds.US Pharmacopeial Convention，Rockwille，Maryland，Pp.84-95)並呈现一种抵抗原性。然而硫酸盐化的胰岛素是一种至少有几种不同的、平均每个分子含有4.5个硫酸盐酯基团的胰岛素衍生物的非均匀混合物。此外，硫酸盐化的胰岛素具有一个低的胰岛素活性，大约是原来胰岛素活性的20%，与原胰岛素比较，硫酸盐化胰岛素的另一个缺点是它们不需要含有通过化学方法改进的氨基酸残基，即不是自然存在的氨基酸。本专利技术的另一个目的是提供同类的胰岛素类似物，生物活性要高于硫酸盐胰岛素，最好只含有天然存在的氨基酸。这里所用的“胰岛素类似物”意思是指一种具有与人胰岛素分子结构类似的化合物，包括在A(7)Cys和B(7)Cys之间、A(20)Cys和B(19)Cys之间含有二硫化物桥，在A(6)Cys和A(11)Cys之间含有一个内二硫化物桥，並具有胰岛素活性。本专利技术基于一个意外的情况，就是在某些胰岛素类似物中至少有一个氨基酸残基已被天然存在的氨基酸基所取代，而呈现出令人希望的速效活性。广义讲，本专利技术通过用天然存在的氨基酸残基取代人胰岛素的一个或多个氨基酸基，提供了一种新型的速效人胰岛素类似物，它降低了自身联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势，並在中性pH值将具有与人胰岛素相同的或更大的负电荷。为了降低自身联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势，最好在分子的相应位置上用比天然氨基酸基亲水性更强的其他氨基酸基取代人胰岛素的某些残基。也可以在胰岛素分子的某些位置上用更庞大的氨基酸基取代，从而降低胰岛素分子联合成二聚物、四聚物、六聚物或多聚物的趋势。更具体地说，本专利技术提供了一种具有如下通式Ⅰ的新型胰岛素衍生物A链 其中X′是人胰岛素的氨基酸残基，它们的网格功能使分子在中性pH值时具有与人胰岛素相同的电荷，或比人胰岛素的电荷更大的负电荷，但条件是在胰岛素分子中相应的位置上至少有一个X与人胰岛素的氨基酸残基不同，並且在A(8)位的X是His或Phe，在A(21)位的X是Asp，在B(5)位的X是Ala，在B(9)位的X是Leu，在B(10)位的X是是Asn或Leu，在B(12)位的X是Asn或者在B(26)位的X是Ala，並在胰岛素分子中相应位置上至少一个剩余的X与人胰岛素的氨基酸基不同。此外还需要一个或多个氨基酸残基可以从A链和/或B链的N终端和/或C终端去除。至少大部份的氨基酸残基取代物的亲水性要比人胰岛素中相应部位上氨基酸基强，最好所有氨基酸残基取代物的亲水性强于相应的人胰岛素的氨基酸残基。关于亲水性，可参考C.Froemmel，J.Theor.Biol.111(1984)，247-260(表1)。参照以上式Ⅰ，与人胰岛素分子中相应位置上的氨基酸基不同的X最好不要多于7个，最佳为2-4个取代物。最好从Asp、Glu、Ser、Thr、His和Ile中选择氨基酸取代基，特别是选择带有负电荷的氨基酸基，即Asp或/和Glu。该新型人胰岛素类似物最好含有Asp和/或Glu，而不是人胰岛素的一个或多个羟基氨基酸，也不是人胰岛素的一个或多个Glu和Asn。该新型人胰岛素类似物进而最好含有Ser和/或Thr，或者Asp和/或Glu，而不是一个或多个具有脂肪性和/或芳香性侧链的人胰岛素氨基酸残基。该新型人胰岛素类似物最好还含有His，而不是一个或多个具有脂肪性和/或芳香性侧链的人胰岛素氨基酸基，也不是一个或多个人胰岛素的羟基氨基酸。取代的最佳部位是在B9、B10、B12、B26和B27、尤其是B9、B12和B27，在这些位置上一个取代就足以能降低自身联合的趋势，並在给药后可产生快速作用。在B9位上的取代氨基酸残基可以从下组中选择Asp、pro、Glu、Ile、Leu、Val、His、Thr、Gln、Asn、Met、Tyr、Trp和Phe，从Asp、Glu、Gln、Asn和His中选取更好。在B12位上的取代氨基酸基可以从Ile和Thr中选择。B10位上的氨基酸取代基可由Asp、Arg、Glu、Asn和Gln中选取，B26位取代和B27位上的氨基酸取代基最好是Asp或Glu。为了获得改善的特性，在胰岛素分子的剩余位置中，看来至少需要有两个取本文档来自技高网...

【技术保护点】
速效的人胰岛素类似物，其特征在于它们具有这样的形式（式１）Ａ－ｃｈａｉｎ＊＊＊Ｂ－ｃｈａｉｎ其中Ｘ是人胰岛素的氨基酸残基或者是相同或不同的氨基酸残基取代基，其基本作用是使该分子在ＰＨ值为中性的时候，具有与人胰岛素相同或者更大 的负电荷，但须在胰岛素分子的相应位置上，至少要有一个Ｘ与人胰岛素的氨基酸残基不同，并且在Ａ（８）位上的Ｘ是Ｈｉｓ，或Ｐｈｅ；在Ａ（２１）位上的Ｘ为Ａｓｐ，在Ｂ（５）位上的Ｘ为Ａｌａ，在Ｂ（９）位上的Ｘ为Ｌｅｕ，在Ｂ（１０）位上的Ｘ为Ａｓｕ或Ｌｅｕ，在Ｂ（１２）位上的Ｘ为Ａｓｎ或者在Ｂ（２６）位上的Ｘ为Ａｌａ，此外，其余的Ｘ中至少有一个Ｘ不同于胰岛素分子相应位置上的人胰岛素的氨基酸残基，并且还须有一个或多个氨基酸残基可以从Ａ和／或Ｂ链的Ｎ和／或Ｃ端上除去。

【技术特征摘要】
DK 1985-8-30 3956/85;DK 1985-10-14 4677/851.速效的人胰岛素类似物，其特征在于它们具有这样的形式(式1)其中X是人胰岛素的氨基酸残基或者是相同或不同的氨基酸残基取代基，其基本作用是使该分子在PH值为中性的时候，具有与人胰岛素相同或者更大的负电荷，但须在胰岛素分子的相应位置上，至少要有一个X与人胰岛素的氨基酸残基不同，並且在A(8)位上的X是His，或Phe；在A(21)位上的X为Asp，在B(5)位上的X为Ala，在B(9)位上的X为Leu，在B(10)位上的X为Asu或Leu，在B(12)位上的X为Asn或者在B(26)位上的X为Ala，此外，其余的X中至少有一个X不同于胰岛素分子相应位置上的人胰岛素的氨基酸残基，并且还须有一个或多个氨基酸残基可以从A和/或B链的N和/或C端上除去。2.根据权利要求1的胰岛素类似物，其中的氨基酸残基取代基比胰岛素分子中相应位置上的人胰岛素氨基酸残基更加亲水。3.根据权利要求1的人胰岛素类似物，其中大约少于7个的X不同于人胰岛素中相应位置的氨基酸残基。4.根据权利要求1的人胰岛素类似物，其中的氨基酸取代基从Asp、Glu、Sen、Thr、His、Ile组成的组中选择。5.根据权利要求1的人胰岛素类似物，其中的氨基酸残基取代基是Asp和/或Glu。6.根据权利要求1的胰岛素类似物，其中在B(9)，B(12)或B(27)位上的X至少有一个不同于人胰岛素分子中相应位置上的氨基酸残基。7.根据权利要求1的人胰岛素类似物，其中B27位上的X为Glu，B12位上的X为Ile或Tyr，A21位上的X为Asp和B27位上的X为Glu，B9位上的X为Asp，A21位和B9位上的X为Asp而B27位上的X为Glu，A8位上的X为His，B9位上的X为Asp和B27位上的X为Glu，B1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰斯约根维尔加德布朗格，克杰德诺里斯，莫根斯特里尔翰森，
申请(专利权)人：诺威北欧公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]