一种干扰基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，本发明专利技术公开一种干扰基因及其应用。本发明专利技术从微拟球藻中克隆并构建了一种干扰基因，所述基因包括外显子1、内含子及外显子2；所述外显子1具有(I)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(II)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。该干扰基因能干扰UDP‑glucose dehydrogenase(UGDH)基因的表达。本发明专利技术发现通过所述基因干扰UGDH表达后，微拟球藻能高效产油且能胞外分泌脂质，得到高产油脂并能进行胞外分泌油脂的藻株。

【技术实现步骤摘要】
一种干扰基因及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种干扰基因及其应用。尤其是涉及一种干扰基因，含有干扰基因的表达载体、宿主细胞，以及生产生物柴油的方法。
技术介绍
生物柴油备受关注，它可以作为一个化石替代品，具有可持续生产和环保等特性。生物能源应用历史已经超过了50年，生物柴油主要来源于植物，例如菜籽，大豆，向日葵等，其原理是由三酰甘油通过酯交换反应制成，1mol三酰甘油和3mol乙醇反应，可以产生1mol的甘油和甲酯。但是，这种生产效率普遍不高，而且占地面积大。与传统的生物柴油相比，微藻具有以下优点：第一，微藻的生长速度快，其生物量可以在24小时增加一倍；第二，含油量高，某些微藻的含油量可以达到干重的50％-60％；第三，微藻的产油效率远远快于动物和植物；第四，微藻能够进行光合作用，参与到生态系统的循环；最后，微藻种类多，适应性非常强，某些微藻可以在极其恶劣的环境下面进行生存，培养条件简单。作为产油微藻的代表藻种之一，微拟球藻属于产油藻，相对其他微藻来说，其产油量相对较高，生长速度快。然而，微拟球藻的产油性能仍不能满足工业需求。而且，植物的细胞壁很厚，提取微藻内的油脂前需要去除其细胞壁，这个环节会大大提高生产成本，同时也会造成细胞的死亡，因此对于工业应用来说，是很不利的。虽然某些非细胞破坏的油脂获取方法已经成功，但是，这还是不能满足微藻的工业产油需求。因此，研发出一种既能高产油又能胞外分泌油脂的工业型微藻，用于解决现有技术中微藻产油效率低、成本高、工序繁多，不能满足工业需求的技术缺陷，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种干扰基因及其应用，用于解决现有技术中微藻产油效率低、成本高、工序繁多，不能满足工业需求的技术缺陷。本专利技术发现对微拟球藻的UDP-glucosedehydrogenase基因(以下简称UGDH)进行RNA干扰，能使其细胞壁中聚多糖显著减少，导致细胞壁变薄，同时使得更多的碳流向三酰甘油合成途径。本专利技术发现UGDH基因表达的蛋白含有471个氨基酸，使用SMART网站和NCBI网站对假定的UGDH基因的蛋白序列进行分析，发现其UGDH蛋白含有3个结构域：UDPG_MGDP_dh_N结构域，UDPG_MGDP_dh结构域和UDPG_MGDP_dh_C结构域(http://smart.embl-heidelberg.de/)，在UDPG_MGDP_dh_N结构域和UDPG_MGDP_dh结构域之间存在一个苹果酸酶和NAD的绑定位点(图1A)。利用MEGA6软件对微拟球藻UGDH蛋白进行系统树构建，发现N.oceanica和N.gaditana具有非常高的同源性。本专利技术提供了一种UGDH基因的干扰基因，依次包括外显子1、内含子及外显子2；所述外显子1具有(I)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(II)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。作为优选，所述外显子2与外显子1的部分序列为反向互补序列。作为优选，所述外显子2具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；或SEQIDNo.3所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。所述外显子1及外显子2之间含有内含子。作为优选，所述内含子具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，或SEQIDNo.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。本领域技术人员可以理解所述取代、缺失或添加一个或多个核苷酸中的多个包括但不限于2个、3个或4个。本专利技术还提供了上述干扰基因在干扰UDP-glucosedehydrogenase基因的表达中的应用。进一步，本专利技术还提供了一种表达载体，含有上述的干扰基因。本专利技术还提供了一种宿主细胞，含有本专利技术所述的表达载体。作为优选，所述宿主细胞为微藻，如微拟球藻、小球藻等。在一些具体实施方案中，所述宿主细胞为微拟球藻。本专利技术还提供了所述宿主细胞在提高脂质含量和促进脂质分泌中的应用。进一步，本专利技术还提供了一种生产生物柴油的方法，将所述宿主细胞在光生物反应器大量繁殖，在宿主细胞达到平台期时收集脂质，分离纯化获得生物柴油。作为优选，所述宿主细胞为微藻。更优选为微拟球藻。微藻通过光合作用固定碳元素，再通过诱导将所述碳元素转化为脂质本专利技术提供了一种干扰基因及其应用，所述干扰基因没有在任何文献报道，在GenBank等公开数据库也没有任何注释。本专利技术从微拟球藻中克隆并构建了一种干扰基因，所述基因包括外显子1、内含子及外显子2；所述外显子1具有(I)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(II)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。该干扰基因能干扰UDP-glucosedehydrogenase基因的表达。将该干扰基因构建到表达载体中转化宿主细胞。在藻细胞内转录后，外显子1和内含子作为发夹前臂和茎环，外显子2为发夹的后臂，会形成茎环发夹结构(图1B)，在dicer酶的作用下，切割形成siRNA，siRNA会与靶基因互补，干扰UDP-glucosedehydrogenase基因的转录表达。本专利技术发现通过所述基因干扰UDP-glucosedehydrogenase表达后，微拟球藻能高效产油且能胞外分泌脂质，得到高产油脂并能进行胞外分泌油的藻株，解决了现有技术中微藻产油效率低、成本高、工序繁多，不能满足工业需求的技术问题。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是UGDH的分子预测分析(A)UGDH蛋白结构域预测分析，(B)UGDH发夹结构示意图；图2是UGDH转化藻的测序比对结果图；图3是UGDH转化藻分子验证胶图，M为marker，右栏为转化藻；图4是UGDH转化藻和野生型藻qPCR分析，**表示(p<0.01)，WT是对照藻，UGDH1和UGDH2是转化藻；图5是UGDH转化藻和野生型藻的光合作用和生长曲线(A)UGDH转化藻和野生型藻的光合作用，(B)UGDH转化藻和野生型藻的生长曲线，其中，WT是对照藻，UGDH1和UGDH2是转化藻，WT是对照藻，UGDH1和UGDH2是转化藻；图6是UGDH转化藻和野生型藻激光扫描共聚焦荧光显微镜结果图，其中，(A)野生型藻，(B)UGDH转化藻，Bar＝5μm；图7是UGDH转化藻和野生型藻透射电镜图，其中，(A)野生型藻，(B)UGDH转化藻.Bar＝5μm；图8是UGDH转化藻和野生型藻总糖含量测定，WT是对照藻，UGDH1和UGDH2是转化藻；图9是UGDH转化藻和野生型藻中性脂含量测定，WT是对照藻，UGDH1和UGDH2是转化藻；图10是UGDH转化藻和野生型藻胞内胞外甘油总酯测定，其中，(A)细胞外甘油总酯产量测定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干扰基因，其特征在于，依次包括外显子1、内含子及外显子2；所述外显子1具有(I)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(II)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种干扰基因，其特征在于，依次包括外显子1、内含子及外显子2；所述外显子1具有(I)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(II)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的干扰基因，其特征在于，所述外显子2具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；或SEQIDNo.3所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列至少有85％同源性的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的干扰基因，其特征在于，所述内含子具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或SEQIDNo.2所示的核苷酸序列经取代、缺...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏业，李达伟，杨维东，刘洁生，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44