一种长链非编码RNA ENSMUST00000139055及其应用制造技术

本发明专利技术的目的之一是提供一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA），命名为lncRNAENSMUST00000139055，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术所提供的lncRNA，通过q-RTPCR方法获得证实，显著高表达于纤维化组织，这一新型的lncRNA将进一步丰富肺纤维化发病及发展机制的研究，也为肺纤维化的早期诊断及预后检测提供了新的检测靶点。

A long chain non coding RNA ENSMUST00000139055 and its application

One purpose of the invention is to provide a human mouse homologous pulmonary fibrosis related long-chain non encoding RNA (Long non-coding RNA, lncRNA), named lncRNAENSMUST00000139055, its nucleotide sequence is shown as SEQ ID No.1. The present invention provides lncRNA, confirmed by q-RTPCR method. The expression level was significantly higher in fibrosis tissue, the new lncRNA will further enrich the study of pulmonary fibrosis and development mechanism, but also provides a new target for the detection of early diagnosis and prognosis of pulmonary fibrosis.

【技术实现步骤摘要】
一种长链非编码RNAENSMUST00000139055及其应用
本专利技术属于生物医学专业领域，涉及一种新型人鼠同源性非编码RNAENSMUST00000139055以及在制备诊断肺纤维化疾病检测试剂药物中的应用。
技术介绍
肺纤维化（Pulmonaryfibrosis，PF）是一种渐进性疾病，由急、慢性肺间质疾病演化而来，是多种间质性肺病终末期的共同状态及病理表现。随着我国各类原因导致的肺纤维化患病率不断上升，肺纤维化已成为我国呼吸系统主要疾病之一，其晚期及急性加重状态在急危重症中的比例不断升高，且与不良预后密切相关。目前临床诊断肺纤维化疾病主要包括以下几种手段：一、影像学检查：胸部高分辨CT（HRCT）检查，能细致的显示肺部病变的位置、程度及性质，对某些类型的肺纤维化如特发性肺纤维化等的诊断具有指导意义。二、肺功能检查：肺功能检查亦是诊断肺纤维化不可缺少的检查项目，有助于了解肺通气与弥散功能等情况，尤其是动态肺功能演变更能反映疾病的发展和预后。三、外科手术活检：可根据肺活检病理做出明确的疾病诊断。但目前的诊断手段和策略都很难做到早期诊断，往往在疾病进展到一定程度以后，患者才因为症状逐渐明显而得到确诊和治疗。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难常在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。当大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力，严重者最后可致死亡。由于肺纤维化后期所带来的严重后果，因此，及早的对其进行诊断具有重要意义，早期诊断，从而做到早期预防和早期治疗以期待获得更好的治疗效果。但在早期阶段，由于现有技术的限制，常被漏诊甚至误诊为其他疾病，容易延误最佳的治疗时期，成为目前临床上呼吸系统疾病的难点之一。近年来表观遗传学成为多种疾病研究的热点与重点，且逐渐成为肺纤维化研究的一个重要方向。表观遗传学是指在基因组DNA序列不变的情况下，通过改变DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体结构参与基因表达调控的一种可逆、可遗传的遗传信息。目前已知，人体基因组中的98%不编码蛋白质的基因组DNA大多可转录产生非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)。而这些ncRNA即介导和参与了表观遗传学的机制。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、miRNA、piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(longncRNA，lncRNA，≥200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处于起步阶段。长链非编码RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA）是一类长度大于200nt、自身不编码蛋白、且物种间相对保守的RNA，已知其可参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰等多种重要生物过程。
技术实现思路
本专利技术通过构建小鼠肺纤维化模型，应用lncRNAmicroassay技术（MouselncRNAMicroarrayV2.0,Arraystar.Inc，探针覆盖31,423条lncRNA、25,376条编码基因），开展小鼠正常肺组织、纤维化肺组织之间差异lncRNA的筛选，通过序列分析，共得到纤维化肺组织相对正常肺组织高表达5倍以上的lncRNA有513条、低表达5倍以上的lncRNA有204条。对芯片检测到的具有人鼠同源性的，差异表达基因、同时又被预测为差异lncRNA可能调控靶标的编码基因，进行Go和Pathway生物信息学分析，发现一条lncRNA-ENSMUST00000139055，其核酸序列如SEQIDNo.1所示。经定量PCR检测结果表明此lncRNA在肺纤维化组织中高表达，而在正常组织中低表达。构建lncRNA的质粒过表达载体，并转染人肺泡上皮细胞A549，结果表明其明显促进了肺泡上皮细胞转化为肌纤维母细胞的上皮间充质转化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT）过程，表现为：细胞形态发生改变，诱导人肺泡上皮细胞中成纤维母细胞标记物：Vimentin、α-SMA、N-cadherin表达增加；上皮细胞标记物：E-cadherin、EpCAM、KRT-5表达下降；细胞外基质标记物：MMP-2、MMP-9表达增加。使用该lncRNA、的质粒过表达载体转染人支气管上皮细胞（HBEc）所获得的结果与A549细胞系的结果一致。本专利技术的目的之一是提供一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA），命名为lncRNA-ENSMUST00000139055，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所提供的lncRNA，通过q-RTPCR方法获得证实，显著高表达于纤维化组织，这一新型的lncRNA将进一步丰富肺纤维化发病机制的研究，也为肺纤维化的早期诊断及预后检测提供了新的检测靶点。本专利技术所提供的人源lncRNA的编码DNA序列定位于HOXA3基因的第2个内含子内，转录方向与HOXA3相反。HOXA3基因位于人类染色体7p15-p14，属于I型同源盒基因（Hox基因）A簇基因的一部分，编码DNA结合转录因子，是参与组织纤维化过程的重要因子。可以通过其特异的“时空”表达模式决定细胞的定向分化与增殖；HOXA3可诱导上皮细胞的迁移，促进血管再生和损伤修复、HOXA3能抑制NF-κB通路的多个成员的表达，特别是能够通过抑制TNF-α的表达，抑制慢性损伤的过度炎症应答反应，从而对异常损伤修复及纤维化的发生发展具有保护作用。该lncRNA存在人同源序列；在人肺泡上皮细胞株A549或者人支气管上皮细胞HBEc中过表达该lncRNA不仅可以抑制其靶基因HOXA3的表达，还能够诱导纤维化标志性蛋白的表达改变，该lncRNA通过参与调节HOXA3，在肺纤维化形成中发挥的重要作用，为早期肺纤维化的治疗提供新分子标记与药物靶点。本专利技术提供的lncRNA序列，既可以通过生物学方法获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给相关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰等。本专利技术提供的人肺纤维化相关的lncRNA，包括与其90％以上同源的核苷酸序列，或经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列，可用于制备诊断肺纤维化疾病的试剂。本专利技术的目的之二是提供所述lncRNA用于制备诊断或辅助诊断肺纤维化的药物或试剂盒的用途。本专利技术目的之三在于提供了一种用于诊断肺纤维化的芯片试剂盒，其中包括：负载有所述lncRNA序列的检测芯片。所述芯片试剂盒还包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等，以及标记RNA样品的标记物、以及与所述标记物相对应的底物。所述的芯片试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。本专利技术还提供了一种用于诊断肺纤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA，其特征在于，ENSMUST00000139055其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或与该序列90%以上同源的核苷酸序列，或该序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的新的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种人鼠同源性肺纤维化相关的长链非编码RNA，其特征在于，ENSMUST00000139055其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，或与该序列90%以上同源的核苷酸序列，或该序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的新的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA用于制备诊断肺纤维化的诊断剂或试剂盒的用途。3.一种权利要求1所述的长链非编码RNA制备的用于诊断肺纤维化的试剂盒，其特征在于，包括：1）用于扩增权利要求1所述长链非编码RNA的特异性引物对；2）标准DNA模板或负载有权利要求1所述长链非编码RNA的检测芯片；3）PCR反应体系。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNo.2，下游引物序列为SEQIDNo.3。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系包括dNTP、PCR缓冲液和DNA聚合酶。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙昊，张劲松，康健，陈旭锋，蒋雷，黄培培，陈伟，钱文溢，
申请(专利权)人：张劲松，
类型：发明
国别省市：江苏,32