一种珍珠母蛋白N16的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种珍珠母蛋白N16的制备方法。该方法利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET32a上，并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysE，用于表达N16蛋白；优选单克隆作为种子培养基接入发酵体系培养，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，诱导N16表达，收集表达菌体；将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。本发明专利技术在现有技术的基础上进一步优化了工艺条件，使产量、纯度更高，操作更为简便易行，并实现了与工业生产的接轨。

【技术实现步骤摘要】
一种珍珠母蛋白N16的制备方法
本专利技术公开了一种珍珠母蛋白N16的制备方法。
技术介绍
骨质疏松症是指以骨量低及组织微结构退行病变为特征、骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。该病在中老年人群中尤为常见。目前治疗骨质疏松症的药物，主要分为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂两类。常用骨吸收抑制剂有双磷酸盐、降钙素等，具有抑制破骨细胞的成熟与功能的活性，但只能减缓骨量流失，不能从根本上治疗骨质疏松症。虽然骨形成促进剂能增加骨量，相对于骨吸收抑制剂有明显优势，但目前市场上骨形成促进剂只有Teriparatide、Preotact等少类药物，价格昂贵，长期使用有可能刺激骨吸收，并增加患者产生骨肉瘤的风险，安全性低。而可双向调节骨重建平衡能力的抗骨质疏松症药物同时具备促进骨形成和抑制骨吸收的作用，具有明显的优势，但只有雷尼酸锶一种药物可供患者选择。研究报道，珍珠母的水溶性蛋白具有促进成骨活性，能促进骨损伤修复，显着提高去卵巢大鼠的骨密度，提高新生鼠颅骨的原代培养细胞和MRC-5(人类胎儿成纤维细胞系)细胞的碱性磷酸酶活性，刺激成骨细胞的分化和产生矿化结节，促进骨形成。珍珠母蛋白具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET32a上，并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysE，涂布于平板并挑取表达效力高的单克隆，用于表达N16蛋白；(2)优选单克隆，接种至基础培养基培养，作为种子培养基；(3)再将种子培养基接种于发酵体系基础培养基，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，诱导N16表达，收集表达菌体；(4)分离纯化步骤：将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。

【技术特征摘要】
2017.01.19 CN 20171004306621.一种珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET32a上，并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysE，涂布于平板并挑取表达效力高的单克隆，用于表达N16蛋白；(2)优选单克隆，接种至基础培养基培养，作为种子培养基；(3)再将种子培养基接种于发酵体系基础培养基，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导N16表达，收集表达菌体；(4)分离纯化步骤：将表达菌体在pH6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述发酵体系的生长条件为pH5.0～9.0，温度为25～37℃，初始溶氧浓度50％～150％，并以乳糖溶液作为补料碳源，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:骤(3)所述发酵体系的生长条件为pH7.0，温度为37℃，初始溶氧浓度100％，待大肠杆菌BL21(DE3)plysE生长到对数期，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述发酵体系的乳糖溶液配方为1L乳糖溶液中含乳糖10～200g，MgSO4·7H2O1～10g。5.如权利要求1或2或3或4所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的发酵体系基础培养基配方为1L基础培养基含酵母粉1～10g，NZ胺1～10g，NaCl1～10g，MgSO4·7H2O1～10g，酸水解酪蛋白1～10g，乳糖1～10g，KH2PO40.1～10g。6.如权利要求5所述的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚宏亮，徐祯彦，彭维，苏薇薇，刘玉铃，林嘉碧，邓沁，李沛波，王永刚，
申请(专利权)人：中山大学，东莞中山大学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44