一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。本发明专利技术所提供的方法包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸、半胱氨酸、腺嘌呤核苷三磷酸、还原型辅酶Ⅱ、尿苷二磷酸葡萄糖、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和磷酸吡哆醛；所述6种蛋白分别为序列表中序列1、3、5、7、9和11所示的MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白。该方法是在现有的植物体内苄基异硫氰酸酯合成途径的基础上，进行改造后获得的。实验证明，该方法可以体外合成出苄基异硫氰酸酯。本发明专利技术为其他途径复杂的异硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法
本专利技术属于微生物领域，涉及一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。
技术介绍
硫苷是一种含硫的阴离子亲水性植物次生代谢产物，几乎存在于所有的十字花科植物中。硫苷晶体的x射线分析证明:所有的硫苷都具有相同的基本结构，其化学结构通常由一个β-D-硫葡萄糖基、一个硫化肟基团以及一个来源于蛋氨酸、色氨酸或苯丙氨酸等8种氨基酸的可变侧链构成。然而硫苷自身并不具有生物活性，当植物受到外界刺激时硫苷-硫苷酶二元系统会被激活，硫苷在硫苷酶的作用下水解并经过一系列的分子重排形成异硫氰酸酯。异硫氰酸酯的生物活性主要体现在抑菌、抗虫害，近年来研究证明萝卜硫素(SFN)、苄基异硫氰酸酯(BITC)、苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)等具有很好的抗癌防癌作用。异硫氰酸酯的前体物质-硫苷合成途径比较复杂，主要分为3部分：前体氨基酸侧链延伸；核心结构形成，次级侧链的修饰。其中核心结构形成是所有硫苷合成的共有步骤。由于苄基异硫氰酸酯的合成以苯丙氨酸为底物只经过核心结构形成这一模块，途径相对简单，可以为其他途径复杂的异硫氰酸酯在微生物中的合成奠定基础。植物体内苄基异硫氰酸酯合成途径具体如下：苯丙氨酸由细胞色素P450家族蛋白CYP79A2催化生成苄基醛肟；再由该家族另外一个蛋白CYP83B1催化生成腈类氧化物，该产物为强亲电子产物立刻和谷胱甘肽发生反应生成S-烷基磺肟酸共轭物；C-S裂解酶(SUR1)进一步催化反应生成苄基硫肟酸、丙酮酸、NH3；葡糖转移酶(UGT74B1)将尿苷二磷酸葡萄糖苷(UDPG)上的葡萄糖基团转移到硫肟酸上形成苄基脱硫硫苷；脱硫硫苷硫酸化酶(SOT16)在3-氧-磷酸腺苷-5-磷硫酸(PAPS)参与下催化脱硫硫苷生成苄基硫苷。苄基硫苷在硫苷酶(MYR)的作用下生成苄基异硫氰酸酯(BITC)。目前有实验推测在植物体内第二步反应产物腈类氧化物在谷胱甘肽硫转移酶(GSTF)的作用和谷胱甘肽反应生成谷胱甘肽共轭物，在由γ-谷酰基蛋白酶(GGP1)作用下生成半胱氨酸-甘氨酸共轭物，该产物在被SUR1催化反应进入后续步骤。植物次生代谢产物通常产量较低，分离纯化工艺复杂，产品纯度低，且纯化过程使用有机试剂会造成环境污染；植物生长周期长，成本高等弊端同样限制了异硫氰酸酯的规模化生产。微生物的生长周期短，成本低等，而且在微生物体内搭建单一植物次生代谢途径可以避免植物本身存在的其他次生代谢途径的竞争问题，实现单一产物的快速、大量表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法。本专利技术所提供的用微生物酶法合成苄基异硫氰酸酯的方法，为体外合成法，具体可包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(Cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)和磷酸吡哆醛(PLP)；所述6种蛋白分别为MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白；所述MA2R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述MB1R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述METC蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述UGT74B1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述SOT18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述BMYR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。在所述方法中，所述MA2R2蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将序列表中序列2所示的MA2R2基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述MA2R2蛋白。所述MB1R2蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将序列表中序列4所示的MB1R2基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述MB1R2蛋白。所述METC蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将序列表中序列6所示的METC基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述METC蛋白。所述UGT74B1蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将序列表中序列8所示的UGT74B1基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述UGT74B1蛋白。所述SOT18蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列10所示的SOT18基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述SOT18蛋白。所述BMYR蛋白具体可按照包括如下步骤的方法制备获得：将序列表中序列12所示的BMYR基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述BMYR蛋白。在所述方法中，具体是按照图1所示的合成途径完成所述苄基异硫氰酸酯的体外合成的。所述反应的条件为：37℃反应0.5-1h(如1h)，加入有机溶剂(如乙酸乙酯或乙醇)后再60℃反应1h。所述反应体系中的溶剂为0.1MpH7.0PBS。本专利技术还保护一种用于体外制备苄基异硫氰酸酯的成套蛋白质或成套基因或产品。本专利技术所提供的用于体外制备苄基异硫氰酸酯的成套蛋白质，具体由6种蛋白组成；所述6种蛋白分别为MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白；所述MA2R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述MB1R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述METC蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述UGT74B1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述SOT18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述BMYR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。本专利技术所提供的用于体外制备苄基异硫氰酸酯的成套基因，具体由6种基因组成；所述6种基因分别为MA2R2基因、MB1R2基因、METC基因、UGT74B1基因、SOT18基因和BMYR基因；所述MA2R2基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述MB1R2基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；所述METC基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；所述UGT74B1基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述SOT18基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示；所述BMYR基因的氨基酸序列如序列表中序列12所示。本专利技术所提供的用于体外制备苄基异硫氰酸酯的产品，具体可为如下(a)或(b)：(a)含有所述成套蛋白质以及7种反应底物；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(Cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)和磷酸吡哆醛(PLP)；(b)含有所述成套基因、大肠杆菌以及7种反应底物；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸(phenylalanine)、半胱氨酸(Cysteine)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸(PAPS)和磷酸吡哆醛(PLP)。所述成套蛋白或所述成套基因或所述产品在体外制备苄基异硫氰酸酯中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术也保护如下蛋白质组或蛋白质。本专利技术所提供的蛋白质组，具体由MA2R2蛋白和MB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外制备苄基异硫氰酸酯的方法，包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸、半胱氨酸、腺嘌呤核苷三磷酸、还原型辅酶Ⅱ、尿苷二磷酸葡萄糖、3′‑磷酸腺苷‑5′‑磷酰硫酸和磷酸吡哆醛；所述6种蛋白分别为MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白；所述MA2R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述MB1R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述METC蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述UGT74B1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述SOT18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述BMYR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。

【技术特征摘要】
1.一种体外制备苄基异硫氰酸酯的方法，包括如下步骤：将7种反应底物和6种蛋白配制成反应体系，反应后获得所述苄基异硫氰酸酯；所述7种反应底物分别为苯丙氨酸、半胱氨酸、腺嘌呤核苷三磷酸、还原型辅酶Ⅱ、尿苷二磷酸葡萄糖、3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸和磷酸吡哆醛；所述6种蛋白分别为MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白；所述MA2R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述MB1R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述METC蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述UGT74B1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述SOT18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述BMYR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述MA2R2蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列2所示的MA2R2基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述MA2R2蛋白；和/或所述MB1R2蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列4所示的MB1R2基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述MB1R2蛋白；和/或所述METC蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列6所示的METC基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述METC蛋白；和/或所述UGT74B1蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列8所示的UGT74B1基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述UGT74B1蛋白；和/或所述SOT18蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列10所示的SOT18基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述SOT18蛋白；和/或所述BMYR蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将序列表中序列12所示的BMYR基因导入大肠杆菌进行原核表达，获得所述BMYR蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的条件为：37℃反应0.5-1h，加入有机溶剂后再60℃反应1h。4.用于体外制备苄基异硫氰酸酯的成套蛋白质，由6种蛋白组成；所述6种蛋白分别为MA2R2蛋白、MB1R2蛋白、METC蛋白、UGT74B1蛋白、SOT18蛋白和BMYR蛋白；所述MA2R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述MB1R2蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述METC蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述UGT74B1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述SOT18蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述BMYR蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。5.用于体外制备苄基异硫氰酸酯的成套基因，由6种基因组成；所述6种基因分别为MA2R2基因、MB1R2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘菲霞，杨寒，王丽敏，于波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11