通过cupin超家族的蛋白质催化的(R)‑选择性cupin‑硝基醛醇反应制造技术

本发明专利技术涉及产生手性β硝基醇化合物的方法。本发明专利技术特别涉及可对映选择性催化亨利反应的(R)‑选择性cupin‑硝基醛缩酶，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin‑硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。

The protein catalyzed by Cupin (R) superfamily of selective Cupin nitroaldol reaction

The present invention relates to methods for producing chiral beta nitro alcohol compounds. The invention particularly relates to the enantioselective catalysis of Henry reaction (R) selective Cupin nitro aldolase, including aldehyde or ketone compounds in nitro Alkane Compounds and nitro Cupin aldolase presence into corresponding beta nitro alcohol compounds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过cupin超家族的蛋白质催化的(R)-选择性cupin-硝基醛醇反应专利
本专利技术涉及产生手性β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。本专利技术特别涉及对映选择性催化亨利反应的(R)-选择性cupin-硝基醛缩酶。
技术介绍
生物催化过程对于化工行业已经变得非常重要。当生物催化剂的性质使两种对映体中的任一种能够与手性或前手性化合物的化学反应中优先反应或形成时，具有特别重要性的是酶的使用。利用酶的这些有利性质的基本要求是如在工业加工中所需的其足量的低成本的可用性、足够高的反应性、选择性和在工业加工的实际条件下的高稳定性。β硝基醇为β氨基醇的前体，其是用于生物活性化合物——如用作药物成分的麻黄碱、苯丁抑制素和鞘氨醇——合成的重要的手性结构单元。硝基醛醇(nitroaldol)或亨利反应是用于C-C键形成的有机合成中经典命名反应之一。由于创建达两个新的手性中心的潜力，其能够对映选择性和立体选择性地进行硝基醛醇加成对于合成应用是至关重要的。尽管该反应已经被熟知一个多世纪(Henry，1895)，但是利用非酶有机催化剂或手性金属催化剂的立体特异的方案最近才被开发。这些方法的发展是令人印象深刻，但它们仍然有许多缺点，包括长的反应时间、并在金属催化剂的情况下有时极端的反应条件、或者在有机催化剂的情况下选择性不足。在过去十年中，第一个不对称的生物催化硝基醛醇反应被发现针对来自热带橡胶树巴西三叶胶(Heveabrasiliensis)(HbHNL)羟基腈裂解酶(hydroxynitrilelyase)(Purkarthoferetal.,AngewChemIntEdEngl.200645(21):3454-6,Gruber-Khadjawietal.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1445–1450,Yuryev,R.；etal.,Biocatal.Biotransform.,(2010)28,348；Yuryev,R.；etal.；Chemcatchem,(2010)2,981))。属于α/β水解酶超家族的类似HbHNL的来自木薯(Manihotesculenta)的(S)-选择性MeHNL，也能够催化(S)-选择性硝基醛醇反应，虽然具有较低的活性和选择性。催化(R)-选择性HNL催化的亨利反应的第一(R)-选择性HNL是来自Arabidobsisthaliana的AtHNL(Fuhshukuetal.J.Biotechnol.2011,153,153-159)，其也属于类似(S)-选择性硝基醛缩酶的α/β水解酶超家族。相比之下，硝基醛醇反应中的活性到目前为止尚未针对来自属于不同蛋白质折叠的Prunusamygdalus(PaHNL)的(S)-选择性羟基腈裂解酶而显示。然而，不幸的是，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL的反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加(Fuhshukuetal.2011)。施用每mmol苯甲醛40mgAtHNL，Asano和同事实现了具有50％乙酸正丁酯(30％产率和91％ee)的pH为7的两相系统中苯甲醛和MeNO2的最高对映体选择性。通过施用较大量的酶(100mg每mmol底物)进一步略微改善了产率和对映体过量。根据底物和反应系统，产率达60％或对映体过量达96％可以通过施用每mmol底物40mgAtHNL和2小时的反应时间实现。然而，其在相同的反应条件下不能共存。然而，在报告的反应条件下在延长的反应时间(2小时至4小时)内AtHNL反应产物的对映体过量显著减少，而产率没有增加。没有使用硝基乙烷。Gotor和同事报道了通过水中载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)的硝基醛醇反应的蛋白质介导的催化，其可以被归类为有机催化，因为科学家的观察导致非特异性蛋白催化的结论。(Busto,E.；Gotor-Fernandez,V.；Gotor,V.,Org.ProcessRes.Dev.,(2011)15,236)。生物催化的硝基醛醇反应也报道于酶(有关综述，参见Milner,S.E.；etal.,Eur.J.Org.Chem,(2012),3059)，诸如转谷氨酰胺酶(Tang,R.C.；etal.,J.Mol.Catal.B:Enzym.,(2010)63,62)、水解酶(Wang,J.L.；etal.,J.Biotechnol.,(2010)145,240)、蛋白酶(Lopez-Iglesias,M.；etal.,Adv.Synth.Catal.,(2011)353,2345)、脂肪酶(Le,Z.-G.；etal.,GreenChem.Lett.Rev.,(2013)6,277；Xia,W.-J.；etal.,Molecules,(2013)18,13910)、酰基转移酶(Xia,W.-J.；etal.,Molecules,(2013)18,13910)和葡糖淀粉酶(Gao,N.；etal.,RSCAdv.,(2013)3,16850)，但在所有情况下，反应不是对映选择性或均没有提供关于对映体选择性的数据。因此，到目前为止，只有具有α/β水解酶折叠的植物HNL能够催化对映选择性的硝基醛醇反应。另一种方法是化学-酶促方法，其中立体异构体的化学合成的混合物通过酶动力学拆分，例如使用水解酶来分离。然而，动力学拆分的主要缺点一般是产率被限制为50％最大值。因此，仍然需要新的硝基醛缩酶，其可以对映选择性催化亨利反应。最近，具有cupin折叠的新细菌HNL的发现已经被报道(Hajnal,I.；etal.,FebsJ.,(2013)280,5815；Hussain,Z.；etal.,Appl.Environ.Biotechnol.,(2012)78,2053)，但只显示非常低的特异性活性。新的酶之一，GtHNL，被详细表征，其结构被分析(Hajnal,I.；etal.,FebsJ.,(2013)280,5815；A.；etal.,ActaCrystallogr.F,(2012)68,451)。它是具有约15kDa分子量的小的金属依赖性的单cupin，其形成四聚体。专利技术概要本专利技术的目的是提供用于产生β硝基醇化合物的改善的方法。该方法包括提供醛或酮化合物和在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下将化合物转化成相应的β-硝基醇化合物的步骤。本专利技术特别涉及(R)-选择性cupin-硝基醛缩酶，其可以对映选择性催化亨利反应。附图说明图1A：GtHNL(PDB-代码:4BIF)的结构的一个cupin单体的卡通表示。1B：SEQIDNO:1、NO:3和NO:5-10的多序列比对。图2：AcHNL和GtHNL以及GtHNL的三重变体(GtHNL-A40H/V42T/Q110H,简短:GtHNLmut)和AcHNL(AcHNL-A40H/V42T/Q110H,简短:AcHNLmut)与苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的双相系统中的硝基醛醇反应。使用澄清的裂解物(酶/mmolBA的量是指酶本身，假设总裂解物蛋白的约50％是HNL)或者纯化的酶。转化率和ee本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin‑硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.12 EP 14172208.21.一种产生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烃化合物和cupin-硝基醛缩酶的存在下转化为相应的β硝基醇化合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述cupin-硝基醛缩酶包含根据图1A的保守桶结构域。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录CL0029的cupin超家族的保守桶结构域。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述cupin-硝基醛缩酶包含具有PFAM登录PF07883的cupin超家族的保守桶结构域。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中式I的化合物与式II的化合物在cupin-硝基醛缩酶的存在下反应，得到式III的β硝基醇化合物其中，R1和R2彼此独立地来自H、C1-20烷基、C3-10环烷基、C4-20环烷基烷基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基、3-14元杂环烷基、4-20元杂环烷基烷基、5-20元杂芳基或6-20元杂芳基烷基，任选被一个或多个Ra取代；R3和R4彼此独立地来自H或C1-20烷基，任选被一个或多个Ra取代；和每个Ra独立地是H、卤素、-CF3、-ORb、-NRbRb、-(CH2)nCOORb、-(CH2)nC(＝O)Rb、-(CH2)nCONRbRb、C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和各自的Rb独立地为H或任选地取代的C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和n为0、1、2或3。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述反应在单或双相系统或在乳液中进行。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述β硝基醇化合物在至少55％，优选至少60％，更优选至少75％对映体过量(e.e.)下获得。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述β-硝基醇化合物在至少10％，优选至少20％，更优选至少50％的转化率下获得。9.cupin-硝基醛缩酶，能够催化非对称β硝基醇反应，其中转化率为至少10％，优选至少20％，更优选至少50％。10.根据权利要求9所述的cupin-硝基醛缩酶，其中所述cupin-硝基醛缩酶包含根据图1A的保守桶...

【专利技术属性】
技术研发人员：克斯廷·斯坦纳，曼达娜·格鲁伯，罗马纳·维德尼尔，赫尔穆特·施瓦布，
申请(专利权)人：帕西昂奥地利有限两合公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT