一种检测ST‑II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种ST‑Ⅱ（heat‑stable enterotoxin typeⅡ，ST‑Ⅱ，耐热肠毒素Ⅱ型）型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒及使用方法，属于病原微生物检测技术领域。该试剂盒包含4条引物，所述引物由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP组成。利用本发明专利技术的试剂盒在60℃～63℃恒温水浴反应45min，便可高效特异地检出ST‑II型产肠毒素大肠杆菌。本试剂盒灵敏度达到500fg/μL，其敏感性为常规PCR的1000倍，具有特异性强、灵敏度高、操作简单，判定简单且成本低廉等优点，能较好的满足ST‑II型产肠毒素大肠杆菌的现场检测，为养殖场疫病的现场检测提供了新的平台。

A ST II detection of enterotoxigenic Escherichia coli LAMP kit and method of use

The invention discloses a ST II (heat stable enterotoxin type II, ST II, enterotoxin type II) type of enterotoxigenic Escherichia coli LAMP detection kit and use method thereof, belonging to the technical field of detection of pathogenic microorganisms. The kit comprises 4 primers, wherein the primer comprises a positive outward primer F3, a reverse outer primer B3, a forward internal primer FIP, and a reverse internal primer BIP. The use of the kit in 60 to 63 DEG C constant temperature water bath reaction 45min, can effectively and specifically detect ST II type enterotoxigenic Escherichia coli. The sensitivity of 500fg/ L kit, the sensitivity was 1000 times higher than the conventional PCR, simple with strong specificity and high sensitivity, simple operation, to determine the advantages and low cost, can satisfy the detection of ST II of enterotoxigenic Escherichia coli, provides a new platform for farm blight site detection.

【技术实现步骤摘要】
一种检测ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP试剂盒及使用方法
本专利技术涉及病原微生物检测
，具体说是涉及一种快速检测产肠毒素大肠杆菌ST-II毒素的LAMP检测试剂盒。
技术介绍
大肠杆菌为肠道中最常见的一类细菌。依据它的致病性大致可分为：肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC），侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC）、产毒素性大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）、肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC/STEC）及粘附性大肠埃希菌（EnteroaggregativeE.coli，EAEC）。其中ETEC可产生不耐热性肠毒素（heatlabileenterotoxin，LT）和耐热性肠素（heatstableenterotoxin，ST），从而导致人或是牲畜出现严重的腹泻。目前对产肠毒素大肠杆菌的检测方法有传统的检测方法和基因检测方法。传统的检测方法主要依赖于生理生化鉴定和毒素试验，生理生化试验参照GB4789.3进行，毒素试验是判断大肠杆菌致病性的重要指标。在检测毒素时，常用的方法是家兔结扎回肠试验、乳鼠灌胃试验和双向琼脂扩散试验，然而这些传统的检测方法费时费力，操作复杂，已不能满足基层和临床中及时、灵敏、快速的检测要求，不利于疾病的预防。基因检测技术主要是聚合酶链式反应（PCR），PCR技术是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定，变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原检测的重要技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR、和实时荧光定量PCR等，但该技术需要依靠昂贵的PCR仪器设备，不利于基层生产上推广应用。环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）技术是由日本科学家开发的一种新颖的简便、快速、高效及廉价的核酸体外扩增技术。该技术针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换作用，短时间内便使得产物得到大量扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可通过肉眼直接观察。与常规PCR相比，该技术不需要模板的热变性，温度循环、电泳及紫外观察等过程，反应速度更快。因其具有特异性强、灵敏度高、设备简单、扩增效率高以及产物检测简便等特点，尤为适合基层和现场病原检测工作的需求。近年来，关于LAMP技术的研究已经取得了较大的进展，已经在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中广泛应用。本专利技术采用环介导等温扩增技术，建立了快速检测ST-II型产肠毒素大肠杆菌的方法，提高了检测效率以及灵敏性，为基层准确检测产肠毒素大肠杆菌提供了可能。
技术实现思路
本专利技术提供了一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，目的是实现对产肠毒素大肠杆菌进行特异、快速、简便的现场检测，改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。本专利技术所采用的技术方案是：1.LAMP引物的设计从GenBank检索获得产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素ST-II基因序列，通过MegAlign软件进行同源性对比分析，获得一段ST-II毒素基因的保守序列SEQNO.1，采用PrimerExplorerV4软件设计了4条特异性LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，引物序列分别为：正向外引物F3：5’-GCAATAAGGTTGAGGTGATT-3’；反向外引物B3：5’-GCAACCATTATTTGGGCG-3’；正向内引物FIP：5’-TGATTGTGTAGATGCATAGGCATTATTTCTTCTTGCATCTATGTTCG-3；反向内内引物BIP：5’-TAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTTGCTCCAGCAGTACCATC-3；2.根据所得LAMP引物配制LAMP反应液，构成检测体系，进而组装成一种用于检测产肠毒素大肠杆菌肠毒素ST-II的LAMP试剂盒。本专利技术的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其包含如下组分：（1）反应液I（23μL）：10×Thermopolbuffer2.5μL；2.5mMdNTPmix1～6μL；25mMMgCl20～3μL；8μL/uLBstDNA酶0.2～1.2μL；10μM正向外引物F30.2～0.7μL；10μM反向外引物B30.2～0.7μL；10μM正向内引物FIP2～5μL；10μM反向内引物BIP2～5μL、其余为灭菌超纯水；（2）阳性DNA（2μL）：待测样品DNA；（3）显色液（1μL）：SYBRGreenI。本专利技术中，10×Thermopolbuffer含有200mMpH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、100mM氯化钾（KCl）、100mM硫酸铵（（NH4）2SO4）、20mM硫酸镁（MgSO4）及1％曲拉通X-100（Triton-100）。本专利技术中，显色液SYBRGreenI为1000×SYBRGreenI。进一步优选的，所述LAMP反应液I（23μL）组成为：10×Thermopolbuffer2.5μL；10mM的dNTPs4μL；25mM的MgCl21μL；8μL/μL的BstDNA酶0.6μL；10μM的正向外引物F30.5μL；10μM的反向外引物B30.5μL；10μM的正向内引物FIP2μL；10μM的反向内引物BIP2μL，灭菌超纯水9.9μL。此外，本专利技术还公开了采用上述试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：包括如下步骤：（a）DNA的提取：采用煮沸法提取DNA，取1mL细菌培养物，12000r/min离心5min；加入100μL超纯水，混匀，100℃煮沸，迅速转移至-20℃冷冻5min，然后4℃12000r/min离心5min，取上清，即为待测样品中的DNA；（b）LAMP扩增：配置23μL反应液，取2μL待测样品DNA与反应液混匀，组成25μL反应体系；取1μLSYBRGreen滴加在反应管盖内侧，小心操作以免染料掉入反应体系内；将反应管置于60℃～63℃恒温水浴45min进行LAMP扩增，85℃加热5min灭活酶的活性；（c）取出反应管进行结果判断：倒置反应管，混匀显色液和反应液，若颜色为绿色，则样品中含有ST-II型产肠毒素大肠杆菌，若颜色为橘黄色，则样品中不含有ST-II型产肠毒素大肠杆菌。与现有的技术相比，本专利技术具有如下的优点及效果：1．特异性强：所检测的阴性对照细菌均无阳性结果出现，与PCR结果相一致。2．灵敏度高：普通PCR检测最低限度为500pg/μL，而采用本专利技术检测方法，检测限最低可达到500fg/μL，是普通PCR的1000倍。3．时效性强：普通PCR检测整个过程在2～4小时左右才能得出结果，而采用本专利技术检测方法，只需1小时左右即可做出判断结果。4．环保无污染：普通PCR结束后还要进行琼脂糖凝胶电泳，使用EB染料等对人和环境会造成损害，而采本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ST‑II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：（1）反应液I（23μL）：10×Thermopol buffer 2.5μL；2.5mM dNTP mix 1～6μL；25mM MgCl2 0～3μL；8U/uL Bst DNA 酶 0.2～1.2μL；10μM正向外引物F3 0.2～0.7μL；10μM反向外引物B3 0.2～0.7μL；10μM正向内引物FIP 2～5μL；10μM反向内引物BIP 2～5μL、其余为灭菌超纯水；所述正向外引物F3序列为：5’‑ GCAATAAGGTTGAGGTGATT ‑3’；所述反向外引物B3序列为：5’‑ GCAACCATTATTTGGGCG ‑3’；所述正向内引物FIP序列为：5’‑ TGATTGTGTAGATGCATAGGCATTATTTCTTCTTGCATCTATGTTCG ‑3；所述反向内引物BIP序列为：5’‑ TAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTTGCTCCAGCAGTACCATC ‑3（2）阳性DNA（2μL）：待测样品DNA；（3）显色液（1μL）：SYBR Green I。

【技术特征摘要】
1.一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含以下组分：（1）反应液I（23μL）：10×Thermopolbuffer2.5μL；2.5mMdNTPmix1～6μL；25mMMgCl20～3μL；8U/uLBstDNA酶0.2～1.2μL；10μM正向外引物F30.2～0.7μL；10μM反向外引物B30.2～0.7μL；10μM正向内引物FIP2～5μL；10μM反向内引物BIP2～5μL、其余为灭菌超纯水；所述正向外引物F3序列为：5’-GCAATAAGGTTGAGGTGATT-3’；所述反向外引物B3序列为：5’-GCAACCATTATTTGGGCG-3’；所述正向内引物FIP序列为：5’-TGATTGTGTAGATGCATAGGCATTATTTCTTCTTGCATCTATGTTCG-3；所述反向内引物BIP序列为：5’-TAGACAAATAGCCAAGGAAAGTTGTTGCTCCAGCAGTACCATC-3（2）阳性DNA（2μL）：待测样品DNA；（3）显色液（1μL）：SYBRGreenI。2.根据权利要求1所述的一种ST-II型产肠毒素大肠杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液I（23μL）组成为：10×Thermopolbuffer2.5μL；10mM的dNTPs4μL；25mM的MgCl21μL；8μL/μL的BstDNA酶0.6μL；10μM的正向外引物F30.5μL；10μM的反向外引物B30.5μL；10μM的正向内引物FIP2μL；10μM的反向内引...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱善元，成大荣，吴双，蔡树东，左伟勇，王安平，王永娟，郭长鸣，洪伟鸣，秦枫，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32