DKK‑3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子诊断领域，具体涉及一种DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用。本发明专利技术的DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂体系，包括检测DKK‑3基因启动子区甲基化的探针序列SEQ ID NO.1和检测DKK‑3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQ ID NO.2。本发明专利技术同时提供了含有以上所述的试剂体系的DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂盒。同时，还提供了以上试剂体系或者试剂盒在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。通过检测DKK‑3基因启动子区甲基化水平有效的指导宫颈癌的早期诊断、治疗和评估预后。而且可以实现及时、特异、便捷的诊断。

DKK 3 gene methylation diagnostic system kit and its application

The invention belongs to the field of molecular diagnostics, particularly relates to a DKK 3 gene promoter methylation diagnostic system kit and its application. The invention of the DKK 3 gene promoter methylation diagnostic system, including the detection of DKK 3 gene promoter methylation of the SEQ ID NO.1 probe sequence and detection of DKK gene promoter methylation of non 3 sub regions of the probe sequence of SEQ ID NO.2. The invention also provides a reagent system containing the DKK 3 gene promoter methylation diagnostic kit. In addition, the application of the above reagent system or kit in the preparation of the reagent used in the detection and / or diagnosis of cervical cancer is provided. Early diagnosis, treatment and prognosis by detecting DKK 3 gene promoter hypermethylation in cervical cancer to guide the effective level. Moreover, it can achieve timely, specific and convenient diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其应用
本专利技术属于分子诊断领域，涉及一种用于宫颈癌诊断、治疗和预后评估的试剂体系，具体涉及一种DKK-3(Dipkkopf相关蛋白3)基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其在宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。
技术介绍
宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，高居女性恶性肿瘤的第二位。据世界范围内的统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5％，其中80％的病例发生在发展中国家。全世界每年死于宫颈癌的患者约24万人。我国每年宫颈癌的新发病例数约为13万，死亡约5万例，尽管近年来宫颈癌的诊断和治疗技术取得了巨大的进步，宫颈癌仍然是一种严重威胁妇女健康的疾病。肿瘤的发生是一个复杂的过程，包括了多阶段、多基因的改变，由宫颈上皮内瘤变、早期浸润癌、到浸润癌的连续发展是宫颈癌的发生过程。肿瘤的发生、发展经历了由量变到质变，渐变到突变的过程。手术治疗为主，辅以放化疗仍是目前宫颈癌的治疗手段，然而这些治疗方式具有极大的副作用，并不是所有患者都能适应。所以目前宫颈癌治疗研究的重点转向了新型的，副作用小的治疗。减少宫颈癌发病率的关键是对宫颈病变早期进行及时高效的筛查和正确的处理。宫颈癌的病因一直受到国内外学者所广泛研究，其中人类乳头状瘤病毒(HPV)感染是主要病因之一。虽然宫颈病变患者几乎都能检测到人类乳头状瘤病毒(HPV)感染，但HPV的检出率在宫颈正常的妇女中也较高。HPV感染的人群中即使感染了HPV高危亚型者最终仅有不足5％的发展为宫颈上皮内瘤变，仅有0.5％-1％的患者最终发展成宫颈浸润癌。由此可见HPV感染是宫颈癌发生发展的必须原因，但却不是充分的原因，还需其他辅助因素参与其发生发展的过程。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一，国内外在近年来的研究中发现在宫颈癌的发生发展过程中出现多种基因的甲基化，而且宫颈癌的病变程度与这种表观遗传学的改变呈现一定的相关性。随着人们对DNA甲基化在肿瘤发生相关基因表达的影响的重视程度不断提高，对各类肿瘤疾病DNA甲基化的分析已经成为当前肿瘤分子生物学的一个研究热点，然而目前报道的癌症相关基因众多，基于DNA甲基化的疾病检测方法往往涉及众多基因，造成成本过高，难以普及。Dipkkopf相关蛋白3(DKK-3)是新近发现的抑癌基因，属于DKK基因家族成员之一，经典的DKK家族被认为是Wnt信号传导通路的调控因子，但目前对DKK-3的功能尚未完全清楚，大多数研究表明其具有促进细胞凋亡和肿瘤血管产生的作用，在多种肿瘤细胞中表现为低表达状态其甲基化沉默时导致失去对细胞周期的调控而发生癌变，与肿瘤的发生、进展与转归紧密相关。其基因启动子区甲基化在多种肿瘤中可反映病情及预后，成为肿瘤基因水平的标志物。为了提高宫颈癌的诊疗效率，提高宫颈癌患者的生存率，寻找一种有效的用于宫颈癌早期诊断的方法是十分必要的，而DKK-3基因启动子区的甲基化检测则具有重要的研究价值及应用前景。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题为：弥补现有技术对于宫颈癌诊疗的不足，提高宫颈癌的诊疗效率。本专利技术的目的在于提供一种可用于宫颈癌早期诊断的分子靶标。与传统的诊断方法相比，采用分子标记物来诊断宫颈癌具有及时性，特异性，便捷性的优点，从而使患者在疾病早期能够预知疾病风险，并针对疾病具体特征采取特异性的治疗措施。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：一方面，本专利技术提供了一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂体系，所述试剂体系包括检测DKK-3基因启动子区甲基化的探针序列SEQIDNO.1和检测DKK-3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQIDNO.2。优选的，所述试剂体系还包括特异性扩增DKK-3基因启动子区部分片段的引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。优选的，所述DKK-3基因包括如下序列：(a)编码蛋白序列SEQIDNO.6所示的基因；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQIDNO.6活性的由SEQIDNO.6衍生的蛋白质。优选的，所述DKK-3基因启动子区原始序列如SEQIDNO.5所示。优选的，所述引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4用于扩增SEQIDNO.5序列的第403-507位。优选的，所述探针序列为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM；所述的淬灭基团选自BHQ。本专利技术还提供了一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂盒，所述试剂盒包括以上任一项所述的试剂体系。优选的，所述试剂盒还包括基因组DNA提取试剂体系和/或DNA甲基化检测试剂体系。优选的，所述DNA甲基化试剂体系包括亚硫酸氢盐修饰试剂。本专利技术还提供了以上任一项所述的试剂体系或者以上任一项所述的试剂盒在制备用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用。优选的，所述用于宫颈癌检测和/或诊断的试剂包括检测和/或诊断宫颈癌患病的试剂，检测和/或诊断宫颈癌病理类型的试剂，检测和/或诊断肿瘤最大径的试剂，检测和/或诊断细胞学分级的试剂，检测和/或诊断临床分期的试剂，检测和/或诊断淋巴结转移的试剂，以及检测和/或诊断脉管癌栓的试剂。优选的，所述试剂的使用方法包括如下步骤：(1)利用基因组DNA提取试剂体系提取被测者宫颈脱落细胞全基因组DNA；(2)利用DNA甲基化检测试剂体系，对步骤(1)得到的全基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰；(3)对步骤(2)中修饰过的DNA利用甲基化探针序列SEQIDNO.1，引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4荧光定量PCR检测DNA的甲基化水平；利用非甲基化探针序列SEQIDNO.2，引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4荧光定量PCR检测DNA的非甲基化水平。本专利技术所取得的有益效果为：首次公开了DKK-3基因甲基化诊断试剂体系、试剂盒及其在宫颈癌检测和/或诊断的试剂领域中的应用，根据DKK-3基因启动子区甲基化与宫颈癌发生，肿瘤大小，细胞系分级以及临床分期之间的相关性，通过检测DKK-3基因启动子区甲基化水平有效的指导宫颈癌的早期诊断、治疗和评估预后。与传统检测方法相比，本基因诊断更及时、更特异、更便捷，能够实现宫颈癌的早期诊断，从而能够更早的采取针对性治疗措施，降低动脉血栓病症的死亡率。具体实施方式如上所述，本专利技术提供了检测DKK-3基因启动子区甲基化水平的试剂体系、试剂盒在宫颈癌早期诊断中的应用。其中，本专利技术所提到的试剂体系、试剂盒等包括：通过标本采集、基因组DNA提取，定量PCR等过程检测宫颈脱落细胞DKK-3基因启动子区甲基化水平以诊断宫颈癌的各种试剂、试剂盒等相关产品。进一步，所述标本采集试剂体系包括液基薄层细胞学检测工具；所述基因组DNA提取试剂体系包括基因组DNA提取试剂盒；所述定量PCR检测DKK-3基因启动子区甲基化水平的试剂体系包括：DNA甲基化检测试剂盒，特异性扩增DKK-3基因启动子的引物，特异性检测甲基化DKK-3基因启动子的探针以及特异性检测非甲基化DKK-3基因启动子的探针。本专利技术的具体实施方案中，所述定量PCR检测DKK-3启动子区甲基化水平的产品至少包含一对特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DKK‑3基因启动子区甲基化诊断试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括检测DKK‑3基因启动子区甲基化的探针序列SEQ ID NO.1和检测DKK‑3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂体系，其特征在于，所述试剂体系包括检测DKK-3基因启动子区甲基化的探针序列SEQIDNO.1和检测DKK-3基因启动子区非甲基化的探针序列SEQIDNO.2。2.根据权利要求1所述的试剂体系，其特征在于，所述试剂体系还包括特异性扩增DKK-3基因启动子区部分片段的引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。3.根据权利要求1或2所述的试剂体系，其特征在于，所述DKK-3基因包括如下序列：(a)编码蛋白序列SEQIDNO.6所示的基因；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有SEQIDNO.6活性的由SEQIDNO.6衍生的蛋白质。4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂体系，其特征在于，所述DKK-3基因启动子区原始序列如SEQIDNO.5所示，优选所述引物序列SEQIDNO.3和SEQIDNO.4用于扩增SEQIDNO.5序列的第403-507位。5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂体系，其特征在于：所述探针序列为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM；所述的淬灭基团选自BHQ。6.一种DKK-3基因启动子区甲基化诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的试剂体系。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏飞，王菁蕊，刘宝利，韩雪，
申请(专利权)人：天津脉络生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12