瘿椒树亲缘关系鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种瘿椒树亲缘关系鉴定的方法，对不同居群的样本材料进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色拍照并记录结果，利用获得的[0,1]数据矩阵表用遗传分析软进行分析，准确的对不同种群之间进行了亲缘关系分析，构建遗传关系树状图，区分了不同的种群。同时，用此方法对不同居群不同性别间的遗传演化关系进行了研究，推测瘿椒树目前的雄全异株繁育系统由最原始两性繁育而来。本发明专利技术反应稳定、扩增片段清楚、多态性高，能准确快速对瘿椒树不同种群间的亲缘关系和遗传多样性进行分析，能快速、准确地进行聚类分析，区分不同种群。

Identification method for phylogenetic relationship of gall pepper tree

The invention discloses a method for identification of genetic relationship of Tapiscia sinensis, in different populations of sample materials were amplified by PCR, polyacrylamide gel electrophoresis, silver staining pictures and record the results, obtained using the [0,1] data matrix by genetic analysis software analysis, accurate of between different species of phylogenetic analysis and to construct the genetic dendrogram between different populations. At the same time, this method was used to study the genetic evolution relationship among different populations, and it was inferred that the male reproductive system at present is from the most primitive male and female breeding. The reaction of the invention is stable, clear and high polymorphic amplified fragments, can quickly and accurately to Tapiscia sinensis populations genetic relationship and diversity analysis, can quickly and accurately by using cluster analysis, distinguish between different populations.

【技术实现步骤摘要】
瘿椒树亲缘关系鉴定方法
本专利技术属于苗木育种
，涉及一种苗木育种的检测方法，具体涉及一种瘿椒树亲缘关系鉴定的方法。
技术介绍
瘿椒树(TapisciasinensisOliv)属于瘿椒树科，是一种多年生落叶乔木，种群中雄株和两性株异株(雄全异株)，雄株不结果，两性植株6月初完成受精,受精后果实进入休眠状态直至第二年三月才开始发育，其自然种群中两性花可以产生可育花粉。瘿椒树为我国特有的古老的第三纪古热带孑遗树种，国家三级保护植物。其作为一种古老濒危树种，在研究生物进化，植物繁育系统演化，性别决定机制方面具有重要理论意义。SRAP(Sequence-RelatedAmplfiedPolymorphism，序列相关扩增多态性)DNA分子标记技术是美国加州大学Li与Quiros于2001年中开发出来的一种新型的基于PCR的双引物分子标记技术。其利用正向引物的CCGG与外显子区域结合而反向引物的AATT与内含子区域和启动子区域结合的特点对基因保守的ORF(openreadingframe，开放阅读框)进行扩增，扩增结果与表型/基因型具有密切相关性，同时因为其具有很高的操作简易性和扩增多态性，SRAP标记在物种种群遗传结构及亲缘关系分析中得到了广泛的应用。目前已经成功应用于甘蓝，西葫芦，野牛草，棉花，荔枝等作物遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建，遗传亲缘关系分析等方面。瘿椒树传统的育苗方式主要两种类型,即有性繁殖和无性繁殖,有性繁殖以种子繁殖为主。在苗木育种亲本选配中，传统方法依靠育种学家的田野形态鉴定手段，这在很大程度上限制了新品种选育的准确性和可靠性，分子标记的手段则有助于在育种之前提前理清育种材料之间的亲缘关系，大大节省了育种周期，节省了育种成本，提高了可靠性。在瘿椒树中利用SRAP分子标记方法进行亲缘关系鉴定和遗传多样性分析尚未见报道。
技术实现思路
鉴于现有技术存在问题，本专利技术的目的在于提供一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，该方法操作简单，周期短，成本低效率高，对于瘿椒树育种中亲本选配具有重要指导价值。本专利技术采用以下技术方案来实现,包括如下步骤：一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，包括以下步骤，(1)提取不同居群瘿椒树基因组DNA，构建总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池；(2)分别以总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池为模板进行SRAP-PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带；以总DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQIDNO.1～NO.20；以雄性DNA池为模板或以两性DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQIDNO.21-NO.40；(3)根据所述多条多态性条带得到不同居群不同性别瘿椒树的DNA指纹图谱；(4)根据DNA指纹图谱表分别得到不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系树状图。步骤(1)中提取基因组DNA是通过瘿椒树幼嫩叶片提取；构建DNA池具体步骤包括：将每个居群瘿椒树雄性基因组DNA和两性基因组DNA等重量混合构建对应居群总DNA池，每个居群瘿椒树雄性基因组DNA构成对应居群雄性DNA池，每个居群瘿椒树两性基因组DNA构成对应居群两性DNA池。步骤(2)中银染显色的染色液为质量浓度0.02％AgNO3。所述步骤(4)具体包括：根据DNA指纹图谱表，计算不同居群瘿椒树间的遗传相似系数，通过遗传相似系数，采用非加权类平均法聚类分析，构件反映不同居群瘿椒树亲缘关系的树状图。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术所选用的引物对在不同居群瘿椒树中反应稳定，扩增片段清楚，利用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用银染显色的方法获得的电泳条带多态性高，条带清晰，有利于结果统计。同时整个方法操作流程简单，用时短，成本低。(2)采用本专利技术方法可揭示不同瘿椒树种群间的亲缘关系远近，说明种群间的遗传多样性，从而在分子水平上加深对瘿椒树种质资源的亲缘关系的认识，可以为瘿椒树种质资源的准确鉴定，杂种优势的预测，亲本选配，苗木遗传分子育种等提供参考。(3)本专利技术将SRAP分子标记技术用于瘿椒树雄性及两性亲缘关系鉴定，能准确成功的辨析不同瘿椒树地理居群中，不同性别植株的演化关系，在研究被子植物繁育系统演化方面具有重要意义。附图说明图1是利用不同引物(P1：F1R10，P2:F1R17)对不同居群总DNA池进行SRAP-PCR扩增后用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2是利用引物F1R10对不同居群雄性及两性进行SRAP-PCR扩增后用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3为基于10对SRAP引物对瘿椒树7个地理种群10个样本(总DNA池为模板扩增)进行遗传相似度分析结果表。图4为基于10对SRAP引物对瘿椒树7个地理种群10个样本(总DNA池为模板扩增)进行亲缘关系和聚类分析所构建的树状图。图5为基于10对SRAP引物对瘿椒树7个地理种群17个样(雄性DNA池及两性DNA池为模板进行扩增)本进行亲缘关系和聚类分析所构建的树状图。图6为基于对比例1的条带。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。多态性条带为分子标记中的常规概念，多态是指不同个体对于同一分子标记PCR条带不同，条带的有无，大小，多少等。实施例1：本实施例提供一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，具体过程如下：(1)提取不同居群瘿椒树雄性基因组DNA和两性基因组DNA，分别构建不同居群和不同性别的DNA池；DNA提取：对采集自七个不同居群共十个雄性样本和十一个两性样本(除SNB，其余样本两性果实均在受精后第二年发育)的瘿椒树幼嫩叶片进行硅胶干燥保存，具体的采样点编号，样地名称，及采集数量见表1。表1采集信息采用TIANGEN的PlantGenomicDNAKit对上述11组瘿椒树雄性及两性植株幼嫩叶片进行基因组DNA提取，每组提取雄性5株DNA，两性5株DNA。具体操作过程按照此试剂盒说明书严格执行即可，说明书略。构建DNA池：按照BSA(bulkedsegerantanalysis，群体分离分析方法)，在每组中取雄性及两性植株各五株的DNA等量混合构建此样本的总DNA池，获得XY，QL，NS32，NS101，XX，YS，SK，XF，YN，SN共10个SRAP-PCR扩增用总DNA池。其中QL，NS32，NS101均采自样地宁陕，XX，YS均采自样地永顺。这样做的目的是为了对最终所构建的亲缘关系和聚类分析树状图的准确性进行检验，检验标准为：如果树状图将同一取样地的不同样本聚为一类，则说明所构建的树状图准确性及可靠性高，能准确反映瘿椒树不同地理居群之间的亲缘关系，遗传进化关系。相反，如果树状图将同一取样地的不同样本没有聚为一类，则说明所构建的树状图准确性及可靠性差，不能准确反映瘿椒树不同地理居群之间的亲缘关系，遗传进化关系。按照BSA在每组中，分别取雄性5株的DNA等量混合构建该组雄性样本的DNA池，分别取两性5株的DNA等量混合构建该组两性样本的DNA池，获得XY，QL，NS32，NS101，SN，XX，YS，SK，XF，YN，共10个雄性SRAP-PCR扩增用DNA池，XY，QL，NS32，NS101，SN,SNB,XX，YS，SK，XF，YN，共11个两性SRAP-PCR扩增用DNA池，其中NS32，NS101均采自样地宁陕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，包括以下步骤，(1)提取不同居群瘿椒树基因组DNA，构建不同居群总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池；其特征在于，所述方法还包括以下步骤，(2)分别以总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池为模板进行SRAP‑PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带；所述以总DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQ ID NO.1～NO.20；所述以雄性DNA池为模板或以两性DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQID NO.21～NO.40；(3)根据所述多条多态性条带得到不同居群瘿椒树的DNA指纹图谱表及不同性别瘿椒树的DNA指纹图谱表；(4)根据DNA指纹图谱表，分别得到反映不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系的树状图。

【技术特征摘要】
1.一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，包括以下步骤，(1)提取不同居群瘿椒树基因组DNA，构建不同居群总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池；其特征在于，所述方法还包括以下步骤，(2)分别以总DNA池、雄性DNA池和两性DNA池为模板进行SRAP-PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带；所述以总DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQIDNO.1～NO.20；所述以雄性DNA池为模板或以两性DNA池为模板时，采用的引物共10对，包括SEQIDNO.21～NO.40；(3)根据所述多条多态性条带得到不同居群瘿椒树的DNA指纹图谱表及不同性别瘿椒树的DNA指纹图谱表；(4)根据DNA指纹图谱表，分别得到反映不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系的树状图...

【专利技术属性】
技术研发人员：任小龙，刘文哲，贾国伦，杨柯，辛桂亮，刘惠东，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61