双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于核酸检测领域，具体涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。所述试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，能够与miRNA竞争结合第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，第二发卡结构DNA探针与第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，其中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到G四联体扩增产物。利用本发明专利技术的试剂盒和方法对miRNAs进行测定，操作简便，成本低，灵敏度高，特异性好。

Reagent kit and method for bidirectional signal amplification detection of miRNA

The invention belongs to the field of nucleic acid detection, in particular to a reagent box and a method for bidirectional signal amplification and detection of miRNA. The kit includes: (1) the first hairpin DNA probe can be paired with the miRNA base, thereby opening the hairpin structure; (2) second hairpin DNA probe to the first hairpin DNA probe combined with miRNA competition, thus the release of miRNA and DNA complex second DNA probe and the first card structure the formation of the hairpin DNA probe has at least one cohesive end; (3) circular DNA probe, a continuous base and DNA complex which a complementary sticky ends, and the circular DNA probe and the DNA complex can be amplified through G amplification products of four conjoined rolling ring. The reagent kit and the method of the invention have the advantages of simple and convenient operation, low cost, high sensitivity and good specificity for the determination of miRNAs.

【技术实现步骤摘要】
双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法
本专利技术涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是存在于真核细胞中的一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子RNA，长约18-24nt。miRNAs通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上特异性抑制或沉默基因的表达，因此miRNAs广泛参与了生物体多种生理过程，如个体发育、细胞增殖、分化和凋亡、代谢与应激反应的调节，甚至疾病的发生，包括肿瘤形成。miRNAs还参与了肿瘤细胞重要的生物程序调控，间接地起着促癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用，因此miRNAs被视为肿瘤早期诊断、预后和治疗的重要潜在生物标记物和靶标。滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制发展起来的一种信号放大的检测方法。RCA是一种等温信号扩增方法，可在室温下进行，使用两个引物就可实现指数滚环扩增，可用于极微量生物标记物的检测。硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种商业化的水溶性苯并噻唑荧光染料，以前常用于淀粉体的检测，近些年有研究发现，ThT可专一性的与DNA/RNA的G-四联体结合并显著增强其荧光强度，而不能与DNA/RNA的其它结构(三联体、二联体和单链)结合，因此可以显著降低检测背景。miRNAs具有短序列、高同源、低含量和极易降解的特性，因此在生物医学研究和早期临床诊断方面急需高效，特异的miRNAs检测方法。传统的miRNAs的检测方法主要有Northernblot，微阵列和实时定量PCR(real-timePCR)，这些检测方法不仅需要使用大型昂贵的仪器设备，操作繁琐，而且灵敏度低，特异差，因此很难普及。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好和成本低的双向信号扩增特异性检测循环microRNA的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，该试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，所述第一发卡结构DNA探针能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，所述第二发卡结构DNA能够与miRNA竞争结合所述第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，所述第二发卡结构DNA探针与所述第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物。优选地，所述试剂盒还包括：(4)ThT荧光染料。根据本专利技术，所示粘性末端的长度优选为10-20nt。所述ThT荧光染料(ThioflavinT)的结构如式I所示。其合成方法已为本领域技术人员公知。也可商购获得。为便于检测，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针优选共同以检测溶液1的形式提供。其中，所述检测溶液1中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针的浓度可根据需要确定，通常均为0.1μM-10μM。所述检测溶液1可以为Tris-HCl缓冲液，也可以根据需要调整为其他缓冲溶液。优选地，所述试剂盒还包括滚环扩增所需试剂。所述滚环扩增所需试剂为本领域技术人员公知，包括但不限于滚环扩增DNA聚合酶、滚环扩增反应液、dNTPs。为便于检测，优选地，所述环状DNA探针与所述滚环扩增所需试剂共同以检测溶液2的形式提供。所述检测溶液2中，所述环状DNA探针的浓度可以根据需要确定，优选为10nM-1000nM。本专利技术的试剂盒用于miRNA检测基于以下原理，如图1所示：检测体系包含两步反应，当待检测物靶标(target)存在的时候，target首先会与第一发卡结构DNA探针(HP1)结合并将其展开，展开后的HP1会继续与第二发卡结构DNA探针(HP2)结合，将HP2展开的同时也会释放target进入第一步反应的循环。由于形成的HP1和HP2复合体中有一段粘性末端与环状DNA探针互补，因此在DNA聚合酶和dNTPs的作用下会进行滚环扩增(HP-RCA)，产物是含有大量多G重复序列(与环状DNA完全互补)的G四联体。最后将ThT荧光染料加入该扩增体系中，通过荧光信号的强弱对比来判断miRNA含量的高低。在没有待检测物miR-21的时候，HP1将不会被打开，因此后续两步反应将无法进行，检测信号极弱。根据本专利技术的上述原理，本领域技术人员可以根据特定的待测miRNA，设计相应的第一发卡结构DNA探针、第二发卡结构DNA探针和环状DNA探针的核苷酸序列。本专利技术提供一种优选实施方式，针对miRNA21(SEQIDNO：4)进行检测，以证明本专利技术。但是本领域技术人员可以确认，本专利技术的检测并不限于miR-21。5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’(SEQIDNO：4)具体地，针对所述miRNA为miR-21的情况；所述第一发卡结构DNA探针(HP1)具有SEQIDNO：1所示的碱基序列；所述第二发卡结构DNA探针(HP2)具有如SEQIDNO：2所示的碱基序列；所述环状DNA探针(CT)具有SEQIDNO：3所示的碱基序列。5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACGATGTGTAGATAGCTTATCAGACT-3’(SEQIDNO：1)5’-TAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGAGGT-3’(SEQIDNO：2)5’-TACACAATCTCGACTAGTCAGACCCTAACCCTAACCCTAACCCTACAACATGTCTTTGATACCTC-3’(SEQIDNO：3)其中，HP1和HP2中下划线的碱基分别表示互补的序列，它们将分别形成发卡探针的互补区(茎区)。HP1中加粗的碱基(5’端起第1-22位)表示靶标miR-21的互补区。HP2中加粗的碱基(5’端起第1-32位)表示HP1的互补区。CT中加粗的碱基(5’端起第1-6位和第61-65位)表示HP2的互补区，下划线的互补序列将形成G-四联体，即结合和激活ThT的互补区。本专利技术还提供利用上述试剂盒检测miRNA的方法，该方法包括以下步骤：(1)向待测体系中加入第一发卡结构DNA探针和第二发卡结构DNA探针，并孵育；(2)加入环状DNA探针并进行滚环扩增；(3)加入ThT荧光染料进行检测，所述ThT荧光染料加入的时机为：加入环状DNA探针的同时，或滚环扩增完成以后。所述孵育以miRNA充分与第一发卡结构DNA探针结合并被第二发卡结构DNA探针充分竞争结合为目的，条件包括：25-40℃，1-5小时；例如37℃孵育2h。所述滚环扩增的条件为本领域技术人员公知。所述检测的方法可以为酶标仪检测。具体地，本专利技术检测miRNA的试剂盒和方法如下：试剂盒组成：a)检测溶液1：20mMTris-HCl缓冲液(100mMNaCl,5mMMgCl2,pH7.4)，其中含发卡结构的DNA探针H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，所述第一发卡结构DNA探针能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，所述第二发卡结构DNA能够与miRNA竞争结合所述第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，所述第二发卡结构DNA探针与所述第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物。

【技术特征摘要】
1.一种双向信号扩增检测miRNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)第一发卡结构DNA探针，所述第一发卡结构DNA探针能够与所述miRNA碱基配对，从而打开发卡结构；(2)第二发卡结构DNA探针，所述第二发卡结构DNA能够与miRNA竞争结合所述第一发卡结构DNA探针，从而释放miRNA，并且，所述第二发卡结构DNA探针与所述第一发卡结构DNA探针形成的DNA复合体具有至少一个粘性末端；(3)环状DNA探针，所述环状DNA探针中的一段连续碱基与DNA复合体的一个粘性末端互补，并且，所述环状DNA探针与所述DNA复合体能够通过滚环扩增得到含有多G重复序列的G四联体扩增产物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：(4)ThT荧光染料。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针共同以检测溶液1的形式提供。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述检测溶液1中，所述第一发卡结构DNA探针和所述第二发卡结构DNA探针的浓度均为0.1μM-10μM。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宇扬，毛瑜，樊婷婷，李露露，
申请(专利权)人：清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东,44