一种制备N‑糖基化脯氨酸氨肽酶的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种制备N‑糖基化脯氨酸氨肽酶的方法及应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术中毕赤酵母表达的脯氨酸氨肽酶N‑端包含组氨酸标签，利用金属螯合层析对表达的蛋白进行一步纯化，回收率达86.5％，纯化倍数为13.4倍。纯化的氨肽酶被证实发生了N‑糖基化修饰，且糖基化修饰作用使酶的稳定性产生了大幅度的提高。本发明专利技术提供的麦谷蛋白水解的方法，使纯酶与碱性蛋白酶发生协同作用，使游离氨基酸含量由水解前的16.2mg/L提高至2770.1mg/L。

A method of preparation and application of N glycosylated proline aminopeptidase

The invention discloses a preparation method and application of N glycosylated proline aminopeptidase, which belongs to the technical field of enzyme engineering. Proline aminopeptidase N Pichia pastoris expression in the end contains a histidine tag, the expressed protein was further purified by metal chelating chromatography, the recovery rate of 86.5% and the purification factor was 13.4. The purified aminopeptidase was confirmed there was N glycosylation, and glycosylation modification enzyme stability has greatly improved. The invention provides a method for hydrolyzing glutenin to make the pure enzyme cooperate with the alkaline protease, so that the content of the free amino acid is increased from 16.2mg/L before hydrolysis to 2770.1mg/L.

【技术实现步骤摘要】
一种制备N-糖基化脯氨酸氨肽酶的方法及应用
本专利技术涉及一种制备N-糖基化脯氨酸氨肽酶的方法及应用，属于酶工程

技术介绍
脯氨酸氨肽酶(PAP)是一种特异性强的外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重要的应用。但PAP的生产主要面临以下问题：(1)野生菌产量差，且国内外报道的脯氨酸氨肽酶纯化需要过4次层析柱，而回收率仅有0.5％-10％(如表1所示)。(2)常见的脯氨酸氨肽酶最适温度范围为30-45℃，超过该温度会迅速失活，且目前还未有关于该酶热稳定性方面的研究。表1不同来源的脯氨酸氨肽酶的纯化结果及其性质目前对脯氨酸氨肽酶的异源表达研究集中于大肠杆菌及枯草芽孢杆菌等原核宿主，尽管重组蛋白的表达量较高，但又存在以下缺点：1)不易分泌表达、易形成包涵体；2)氨肽酶稳定性差，在最适反应温度50℃保温1h后残留酶活仅为10％；3)纯化效率差，经离子交换层析和凝胶过滤后，得率仅为1.7％。因此，提高脯氨酸氨肽酶的结构稳定性和温度稳定性对于该酶的工业化应用具有十分总要的意义。麦谷蛋白是谷蛋白中的非醇溶性组分，可溶于稀酸与稀碱中，在制备谷氨酰胺肽及阿片肽等方面具有良好前景，目前水解利用麦谷蛋白的方法通常是采用碱性蛋白酶进行单酶水解，但水解后的产物会使反应后的体系呈现苦味，影响食品风味和口感。谷蛋白因含有大量的脯氨酸，由于脯氨酸的特殊结构，在人体内不易被分解而成为引起麸质过敏症的主要因素，大约有9％的中国居民对麸质具有不同程度的不良反应，而目前预防该病的唯一方法是无麸质饮食。Matysiak-BudnikT等人利用脯氨酸内肽酶对谷蛋白进行降解来预防该病，但由于内肽酶分解能力较差，需要高浓度的内肽酶才能将作为过敏源的目的多肽(长度约30-40个氨基酸)完全切割。此外最新研究表明，市售的5种声称具有降解谷蛋白免疫原功能的酶制剂补充剂(有效成分为酸性蛋白酶、二肽酶及亮氨酸氨肽酶)均不能有效降解导致免疫应激反应的多肽。因此利用脯氨酸氨肽酶与碱性蛋白酶复配应用于谷蛋白过敏源肽的去除，可能提供一种预防麸质过敏症的新方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种纯化毕赤酵母生产的脯氨酸氨肽酶的方法，所述方法是在SEQIDNO.1所示基因编码的脯氨酸氨肽酶的N端融合6×组氨酸标签。在本专利技术的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。在本专利技术的一种实施方式中，以pPIC9K为表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，主要包括以下步骤：(1)在SEQIDNO,1所示脯氨酸氨肽酶的N-端融合6×组氨酸标签，与pPIC9K转化至毕赤酵母GS115中，将重组毕赤酵母在BMGY培养基中培养，转接至BMMY培养基中甲醇诱导168h后制备粗酶液；(2)胞内粗酶液经透析后，经过镍柱亲和层析一步纯化。在本专利技术的一种实施方式中，将重组毕赤酵母菌接种至BMGY培养基中，200～250rpm、28～30℃，培养16～24h，转接至BMMY培养基中，200～250rpm、25～28℃培养96～144h，每隔20～24h添加终浓度5mL/L的甲醇诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述透析后还进行0.22μm过滤。在本专利技术的一种实施方式中，所述纯化是采用缓冲液A对Ni-NTA进行平衡后，利用排干法上样，洗脱5个柱体积后，用缓冲液B进行洗脱。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液A和缓冲液B均为咪唑缓冲液，pH7.2～7.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液A含：40mmol·L-1咪唑，50mmol·L-1Tris-HClpH7.5和0.5mol·L-1NaCl。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液B含有：0.5mol·L-1咪唑，50mmol·L-1Tris-HClpH7.5和0.5mol·L-1NaCl。本专利技术的第二个目的是提供一种提高脯氨酸氨肽酶稳定性的方法，所述方法是在脯氨酸氨肽酶N端进行糖基化。在本专利技术的一种实施方式中，是在氨基酸序列的第28-31位NYSR、第316-319位NWSR或第328-331位NFSI处进行糖基化。在本专利技术的一种实施方式中，所述糖基化是在酵母中进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述酵母包括酿酒酵母、毕赤酵母中的至少一种。本专利技术的第三个目的是提供一种酶解麦谷蛋白的方法，所述方法是采用碱性蛋白酶和氨肽酶共同水解；所述碱性蛋白酶的添加量为3000～4000U/g底物，所述氨肽酶的添加量为300～600U/g底物；所述氨肽酶是由SEQIDNO,1所示基因编码而成。在本专利技术的一种实施方式中，酶解过程中控制pH为9.5～11.0。在本专利技术的一种实施方式中，酶解反应2～6h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：调节pH为9.5～10.5，按3000～4000U/g底物添加碱性蛋白酶，按300～600U/g底物添加氨肽酶，45～55℃反应2～5h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：调节pH为9.5～10.5，按3000～4000U/g底物添加碱性蛋白酶，按300～600U/g底物添加氨肽酶，50℃反应3h。本专利技术还提供所述方法在食品领域制备含蛋白的食品中的应用。本专利技术的有益效果：(1)通过在氨肽酶基因的上游添加组氨酸标签，利用镍柱对表达的氨肽酶蛋白进行一步纯化，获得电泳纯的氨肽酶液，回收率达86.5％，纯化倍数为13.4倍，具有回收率高，操作简单等优点，相比于现有技术达到了最高水平。(2)通过对酶的N-糖基化修饰，使脯氨酸氨肽酶的二级结构发生改变，并显著提高了氨肽酶的热稳定性、pH稳定性及耐盐性等。相比在原核宿主大肠杆菌中的表达的氨肽酶在50℃保温1h残留酶活仅为10％，经糖基化修饰后的脯氨酸氨肽酶50℃的半衰期提高到50h，且该温度下在不同pH(6.0～10.0)的条件下6h后酶活仍在65％以上。(3本专利技术提供的麦谷蛋白水解的方法，使纯酶与碱性蛋白酶发生协同作用，酶解反应充分，获得的水解物即可以保证较高的寡肽水平，同时去除了部分寡肽末端的脯氨酸等疏水性残基，使游离氨基酸含量由水解前的16.2mg/L提高至2770.1mg/L。附图说明图1为脯氨酸氨肽酶的一步纯化(M：Marker，1：细胞破碎液上清，2：镍柱纯化的氨肽酶酶液)；图2为脯氨酸氨肽酶的去糖基化分析(M：Marker，1、3：胞内氨肽酶/胞外氨肽酶+EndoHf，2、4：未处理的胞内氨肽酶/胞外氨肽酶；图3为脯氨酸氨肽酶的圆二色谱分析；图4为重组氨肽酶不同温度对应的酶活；(a)最适反应温度曲线；(b)温度稳定性曲线；图5为PAP不同pH对应的酶活；(a)最适pH曲线；(b)50℃时的pH稳定性曲线；图6为重组氨肽酶的储存稳定性；图7为NaCl浓度对PAP活性的影响；(a)不同NaCl浓度对应的酶活曲线；(b)PAP在不同NaCl浓度下的稳定性曲线；图8为麦谷蛋白双酶复配水解液中的多肽分布；图9为麦谷蛋白酶解后水解液中游离疏水氨基酸的含量。具体实施方式所用培养基：BMGY(g/L):蛋白胨20，甘油10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0：BMMY(g/L):蛋白胨20，甲醇10，酵母膏10，YNB13.4，生物素0.4，100mM磷酸盐缓冲液pH6.0；缓冲液A：40mmol·L-1咪唑，50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高脯氨酸氨肽酶稳定性的方法，其特征在于，在脯氨酸氨肽酶N端进行糖基化，所述糖基化是在氨基酸序列的第28‑31位NYSR、第316‑319位NWSR或第328‑331位NFSI处进行糖基化；所述脯氨酸氨肽酶由SEQ ID NO.1所示基因编码。

【技术特征摘要】
1.一种提高脯氨酸氨肽酶稳定性的方法，其特征在于，在脯氨酸氨肽酶N端进行糖基化，所述糖基化是在氨基酸序列的第28-31位NYSR、第316-319位NWSR或第328-331位NFSI处进行糖基化；所述脯氨酸氨肽酶由SEQIDNO.1所示基因编码。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖基化是在酵母中进行；所述酵母包括酿酒酵母或毕赤酵母。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脯氨酸氨肽酶以pPIC9K为表达载体，在毕赤酵母GS115中进行糖基化。4.权利要求1～3任一所述方法制备的脯氨酸氨肽酶。5.一种纯化权利要求4所述脯氨酸氨肽酶的方法，其特征在于，所述方法是在SEQIDNO.1所示基因编码的脯氨酸氨肽酶的N端融合6×组氨酸标签。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115，以pPIC9K为表达载体。7.根据权利要求5所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：田亚平，杨宏宇，刘小峰，周楠迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32