胶原及其制备方法技术

本发明专利技术描述了通过稀有机酸提取、盐沉淀和可能的凝胶化和／或冻干以及切向过滤，而从动物腱或皮肤制备三螺旋、非蹦性的胶原。这样制得的胶原与用常规方法制备的胶原相比，具有高纯度和在治疗过程中具有更高活性，而且它是非变应性的。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从动物组织中获得的纯的和非变性的。胶原形成结缔组织并且是高级脊椎动物中的最丰富的蛋白。在天然中它以具有恒定周期性的三链螺旋的形式存在。至少有五种典型的胶原是天然产生的。其中Ⅰ型胶原是最丰富的，它是皮肤、骨骼和腱的主要组成。腱中存在的Ⅰ型胶原具有α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)链结构，其中α1链和α2链两者是同系的。α1和α2两链通过静电力和氢桥结合，该氢桥与存在的羟脯氨酸结合，而赋予该分子特征强度和韧性。当这些键被保持在提取产物中时，它们的存在阻碍了溶液的形成，而只在极少的情况下，它可以作为在水中蛋白膨胀的结果而于酸性环境中形成凝胶。目前，发现了胶原在医药学方面有许多应用它可用作外科临床，烧伤治疗的治疗剂、用作载体和外科修复术的材料(缝线、纱布等)，用作植入材料以及在药物及化妆品领域中用作制备软膏和油膏的原料。因此，重要的是要尽可能地将胶原处理为非变性的、非变应性的和没有不良杂质或污染物的形式。迄今已知的用于制备胶原的工业化方法并不令人满意，因为这些方法不能制备具有上述所要求特征的化合物。这问题与从腱中提取的胶原特别相关。实际上这种胶原是“酸不溶的”种类，并且在稀乙酸或盐酸中用常规的无机盐提取溶液技术是不易于提取的。因为这些技术要求有蛋白水解酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶)存在的情况下进行。使用这些酶不改变α1和α2链的多肽结构，但引起它们的展开。此外，提取的产物通常是交联的，以便提高和改进其力学特性、降低其免疫原性和增强其抗有机的再吸收能力。通常这种交联法是通过物理方法(光、U.V.、γ-射线、X-射线、α或β粒子、质子、电子)或者通过化学方法(甲醛、戊二醛、乙缩醛、丙酮醛、乙二醛、醌、氨基二醛、氢醌、二甲基丙酮、二甲砜)而完成。用上述方法获得的产物是一种丧失了典型天然胶原结构的产物。通常由腱或皮肤中进行提取时遇到的上述方法的另一个问题是为了除去在提取方法中所用的盐而需要纯化的长耗时的渗析工艺。由于在本专利技术方法中没有使用蛋白水解酶或成网剂，而且比已知方法更为经济，因此本专利技术方法能够解决已知技术的缺点并且能够获得高纯度的非变性产物。本专利技术方法可用于从牛或猪皮或者从牛腱、作为饮食和皮革工业的副产品而易于获得的原料中提取胶原。在腱中提取的情况中，得到的“酸可溶”类的胶原是凝胶形式，该胶原可被冻干以制备在外科临床中常用的那种海绵状片。本专利技术方法包括下列步骤(a)用稀有机酸从生物组织中提取;(b)通过加入无机盐沉淀胶原;(c)用稀有机酸进行可能的胶凝化;(d)通过具有适当特性的膜切向过滤;(e)将最终溶液或凝胶进行可能的冻干。步骤(a)中优选地是在不高于25℃、按生物组织/酸重量比为0.1～0.01的条件下，用浓度为0.5～2M的乙酸水溶液进行。在步骤(b)中优选的是钠盐，而在步骤(c)中，当原料为腱、生产不溶于酸的I型胶原时，则一般可使用相同的稀乙酸进行。在步骤(d)中，首先进行等体积洗涤，然后浓缩。洗涤实际上是通过分子膜的切向过滤，该膜能够去除分子量低于膜分子分离能力的全部化合物，而不取决于它们的性质。同时，溶液或凝胶中所存在的高分子量的胶原保持在液相中并通过蠕动泵循环。因此，通过不断地更新盐酸的操作，起始溶液或凝胶中的所存在的全部杂质可在短时间内去除。通过切向过滤装置再循环凝胶而进行凝胶浓缩。由于在切向过滤的每个通道都有一些液体排出，因而溶液或凝胶变得更浓。当线性压力计指出的操作反压高于40p.s.i.时，工艺可以结束。通常在这些条件下形成的凝胶的浓度在1.5～2%。在溶液情况下(由皮肤起始而获得，它提供一种可酸溶的胶原)，通过测定粘度、羟脯氨酸滴定度等相应的所要求的浓度可以指出操作的结束。 附图说明图1和图2是上述操作的流程图。图3是不同浓度胶原的脱盐情况。图4是不同浓度胶原的浓度曲线图。图1表示了在恒定体积步骤中的洗涤操作，其中1为稀乙酸储槽，2为样品，3相当于过滤膜，而4、5和6分别为蠕动泵、洗涤水出口和样品再循环。实际上，储槽1可以用循环的乙酸本身替代。图2表示溶液或凝胶的胶原浓缩的操作示意图，其中有关的数字的含义与图1相同。所用的过滤膜的上排阻限优选的为10，000至100，000。在步骤(a)、(b)和(c)所产生的胶原溶液或凝胶必须被稀释至0.005～0.5%的浓度，而在洗涤中使用的稀乙酸的浓度为0.01至1M，优选的约0.5M。如果需要用具有药物学活性的物质处理胶原，那么这些物质可在恒定体积脱盐后和浓缩步骤之前直接溶解或分散在储槽中。适当的物质实例是抗生素、维生素、激素和类固醇。对于妇科学领域中的应用，硫酸锌是特别优选的，例如疱疹形式的局部治疗(片、小丸、霜、吸附剂等)。必须溶解或分散的物质量，是按溶液或凝胶浓缩后的相和原料的可能的转变相的倍增因数而计算。按已知方法进行可能的冻干。按照本专利技术方法获得的胶原保持其典型的三螺旋构型，是纯的、不要求交联处理并且是非变应性的。由于这些特性，本专利技术的胶原在治疗外科创伤和烧伤方面更具活性，由于化合物的非变性结构而有天然治疗作用。通过下述实施例将会更好地理解本专利技术。实施例1 从80mg Achille牛腱上剔除肉和脂肪并用绞碎器绞碎。将绞碎的腱用水(三次)、1～10% NaCl水溶液(三次)洗涤，然后用水洗涤，直到洗涤水几乎澄清;每次洗涤都通过倾析液体而进行。按有机物/酸的0.1至0.001的比例将材料悬浮于浓度为0.1～5M的稀乙酸中。在不高于25℃的温度，轻微地搅拌该材料24～72小时。用No.50金属筛过滤该材料，收集液体和固体。向溶液中添加250～1000g NaCl，胶原以乳白色γ-纤维产物形式沉淀。将该产物过滤在No.40金属筛上，用蒸溜水洗涤并储存。将固体部分按上述再悬浮于稀乙酸中并进行提取。重复该方法直到胶原不再发生明显的分离(约3～4次)。将这样得到的全部胶原悬浮于5升0.5M乙酸中并搅拌直到产生完全胶凝化(约24小时)。加入500g NaCl以沉淀胶原，将该胶原过滤在No.40金属筛上，收集固体。通过用5份蒸馏水(每份1升)倾析洗涤该固体，然后再悬浮于0.5升0.5M乙酸中并搅拌直到产生完全胶凝化(约24小时)，接着用相同的乙酸稀释后获得0.75kg胶原凝胶1%(在羟脯氨酸×7.46中的滴定度)。将凝胶转移到渗析膜28/32″上，并用0.5M乙酸渗析，连续地更新以达到从凝胶中去除NaCl。通过表面修正机滚筒(surfacer roller)将原胶分配到方盘中，以恰当地分配非常粘的料块。在约-40℃预冷冻该物质8～10小时，并置于高真空(0.05mm残余压力)16小时。然后以恒定的速度(约2℃/小时)提高温度直到达到30℃。将产物在40℃加热2小时，然后将冻干层冷却并通过半人工剪切方式分割。这样得到的产物具有以下物化参数，这些参数是特征性的和恒定的。化学参数(a)羟脯氨酸含量，通过分光光度法测定，高于13%并且在任何情况下不低于12%; (b)总氮含量，通过克耶达定氮法测定，高于17.5%而不低于16.2%; (c)残留湿度低于20%。物理参数(a)单位重量的浸渍时间不低于15分钟; (b)单位重量水的吸收系数不低于25g; (c)抗剪切不低于2000g/cm2; (d)起皱温本文档来自技高网...

【技术保护点】
由腱或皮肤起始制备非变性胶原的方法，该方法包括下列步骤：（ａ）用稀有机酸从生物组织中提取，（ｂ）通过加入无机盐沉淀胶原，（ｃ）用稀有机酸进行可能的胶凝化，（ｄ）通过适当的过滤膜而进行切向过滤，（ｅ）最终溶液或凝胶的可能的 冻干。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：迪歌弗兰，
申请(专利权)人：尤罗瑞瑟彻公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]