软骨型蛋白聚糖的提取和纯化方法技术

本发明专利技术涉及提取和纯化软骨型蛋白聚糖的新方法，并且提供了粗蛋白聚糖的提取方法，特征在于使用酸作为软骨洗脱溶剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种软骨型蛋白聚糖提取和纯化的新方法。在几乎所有的动物生物体中，蛋白聚糖总是作为细胞外基质的一种重要的成分而存在，与胶原蛋白和透明质酸的存在相似，细胞外基质存在于细胞间(见图2)。并且，它不但是生物体构成的重要部分，而且形成了细胞周围的物理环境，控制各种细胞活性如偶合、增殖或分化。每一种细胞外基质成分或者GAG分别具有诸如贮水、供水、解毒或者止痛的功能。当这些成分相互结合形成大分子结构时每一种成分交互作用，显示出更明显的效果。作为本专利技术目的的软骨型蛋白聚糖与胶原蛋白、透明质酸或GAG相比，具有巨大分子量并且具有复杂的结构。因此，即便是蛋白聚糖本身与细胞外基质中的其他成分相比都具有更好的贮水和供水能力，不仅如此，依靠其GAG部分的生物信息信号组织，还可以具备其他功能。一方面，目前，蛋白聚糖的提取和纯化方法，通常以牛或者鲸鱼的软骨作为起始原料，用有毒的或有害的试剂，如氯仿、甲醇或盐酸胍，通过复杂的过程实现提取和纯化。这种方法被认为没有达到工业化水平。市场上仅有几种作为试剂的蛋白聚糖小量销售，价格大约每克数千万日元。本专利技术的申请人曾经专利技术了一种提取和纯化蛋白聚糖的大量生产的简单方法，用鲑鱼的嗅觉软骨为原料可以实现工业规模，已经申请了专利(日本专利申请11-331375，申请日1999年11月22日)，这种方法实际上包括鲑鱼嗅觉软骨的破碎过程、去油过程、用溶剂提取及渗析过程。通过该方法，以大量生产和低成本为特征的提取和纯化方法得以实现，然而，在该方法中不仅使用氯仿、甲醇或盐酸胍，甚至使用有害试剂如用于蛋白降解酶的阻滞剂。因此，用作进入人体药物的原料及健康食品或补品的添加剂的可能性就比较困难，且其应用被限于非药化学品或化妆品。进一步说，由于上述化学试剂的市场价格相当昂贵，提取和纯化成本的降低是有限的。另一方面，由于本专利申请人展示了一种低成本的蛋白聚糖，从而不仅在化妆品工业而且在食品加工行业、保健食品或补品及药品工业中，对与蛋白聚糖相关物质发展的决心也增强了。然而，对于食品加工行业、保健食品或补品及药品工业，蛋白聚糖的大量应用中，必须对蛋白聚糖的纯化方法给予特殊考虑。通常在传统的蛋白聚糖的提取和纯化方法中，胍的盐酸盐被普遍使用。但是，对于蛋白聚糖的一些新的应用，强烈要求不使用所述胍的盐酸盐以及象氯仿、甲醇或用于蛋白降解酶的阻滞剂这样的有毒或有害试剂。更进一步地，强烈要求发展一种更简单更低成本的蛋白聚糖的提取和纯化方法。本专利技术的专利技术人对蛋白聚糖的提取和纯化方法的发展进行了深入的研究，在该过程中不使用有毒的或有害的试剂，并且以更简单更低成本为特征，进而完成了本专利技术。换句话说，本专利技术的目的是提供更简单更低成本的。也就是，本专利技术的关键在于，在所有的提取和纯化粗蛋白聚糖过程中，用乙酸、氯化钠和非修饰的乙醇替代象氯仿、甲醇或用于蛋白降解酶的阻滞剂这样的有毒或有害试剂。上述的这些试剂，即乙酸、氯化钠和非修饰的乙醇，是在食品加工行业中通常使用的试剂。出于实现更简化提取和纯化方法的目的，在上述专利申请(JPA11-331375)中使用的尿素取代的过程和通过DEAE-Sephacel方法分离和纯化的过程被省略了。图中，每一个数字标识表示如下1核蛋白，2糖胺聚糖链，3透明质酸，4胶原蛋白，5蛋白聚糖。作为本专利技术蛋白聚糖的初始原料，牛或鲸鱼的软骨均可以使用，然而从易于获取和价格的角度出发，倾向于使用鲑鱼的嗅觉软骨。特别是，希望使用在使用鲑鱼的食品加工如罐头工业的生产过程中废弃的白鲑鱼的头部，在日本Aomori县的海边，这种以白鲑鱼为原料的沿海水产业比比皆是。作为本专利技术中所用的乙酸，可以使用任何一种食品用或工业用乙酸，可以根据蛋白聚糖的应用目自愿选择。乙酸洗脱剂的期望浓度按照后面提到的实验结果为大约4％，然而该浓度并不是限定的。实施例以食品加工厂制罐头过程中废弃的白鲑鱼头部为初始原料，该原料从Aomori县的海边沿海水产业获得，头部通常被临时保藏在-30℃的温度下。将上述保藏的原料在4℃解冻20小时，用餐刀从头部剔除嗅觉软骨，初始原料即准备完成，从鲑鱼嗅觉软骨上用镊子去除固体脂肪，再用生理盐水漂洗干净。然后，用手工粉碎机粉成细粉，得到了鲑鱼嗅觉软骨的碎骨肉。将部分所述碎骨肉浸入4℃的商业用稀释到10w/v的酿造醋酸中(稀释到4％浓度，即是乙酸在醋中相同的浓度，因此简称为4％乙酸溶剂)，分别浸泡0，6，12，24，48，72，120，168小时并且搅拌。获得了粗蛋白聚糖的洗脱状态与洗脱时间的变化关系，用咔唑-硫酸法得到糖醛酸的量表示，获得的结果见图3。图3很清楚地表明，洗脱粗蛋白聚糖的量在最初的24小时内有明显的增加，洗脱量的增加在24小时之后不再明显。从获得的结果看，用4％乙酸溶剂洗脱粗蛋白聚糖的最有效时间为48小时。根据上述结果，将50g的鲑鱼嗅觉软骨的碎骨肉浸入4℃、4％乙酸溶剂中48小时，搅拌，以洗脱嗅觉软骨获得粗蛋白聚糖(权利要求1)。然后将洗脱液用不锈钢网(150μm)过滤以去除没有洗出的物质。然后，含粗蛋白聚糖的溶液被离心分离(4℃，10000r.p.m.，20分钟)。将三倍量的氯化钠饱和的乙醇液加入到所得上清液中，再次离心分离(4℃，10000r.p.m.，20分钟)，得到含粗蛋白聚糖的浓缩沉淀(权利要求2)。将所得含粗蛋白聚糖沉淀再次溶于4％乙酸溶剂中，然后将该溶液与水在截留分子量为1000Kda的纤维素酯膜渗析管中充分渗析，获得高纯度的液态蛋白聚糖(权利要求3)。所得液态蛋白聚糖最好冻干以粉末状保藏。在本实施例中将渗析后的内溶液冻干后获得了240mg粉状蛋白聚糖样品。权利要求3方法获得的蛋白聚糖样品按下述方法测得化学特征。化学分析结果见表1表1鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖样品的化学分析 a表示当己糖胺的量以1.00计时的摩尔比表1中，糖醛酸和硫酸酯的量用当己糖胺的量以1.00计时的摩尔比表示，分别为0.99和0.67。显然这三个成分存在的量几乎是相同的。另外，核蛋白的量为6.99％(w/w)，与糖醛酸的比例(核蛋白/糖醛酸)为0.23(w/w)。这个数值是说明蛋白聚糖的纯度的指数并且接近理论值0.2。分析组成该蛋白样品的多种氨基酸，结果表明甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸的量非常高。换句话说，在所有的1000个氨基酸残基中，总的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸残基占386，同时，羟基脯氨酸的残基占2。羟基脯氨酸是胶原蛋白中的典型氨基酸，可以识别到在这种鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖中胶原蛋白的混杂，但是量很少，可以说不显著。因此，可以说得到的鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖纯度非常高。为了获得与鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖分子大小相关的信息，用SB805HQ柱(8×300mm)进行高效液相色谱分析，流出物的位置由215nm处的UV吸收峰所证实。将这个结果与市售的试剂牛嗅觉软骨蛋白聚糖进行比较。在鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖的情况下，从SB805HQ柱流出物的位置(Kav)被认为是在0.28处的一对称峰，而牛嗅觉软骨蛋白聚糖情况下是0.17。这些结果表明鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖分子大小小于牛嗅觉软骨蛋白聚糖。此外，将鲑鱼嗅觉软骨蛋白聚糖的核蛋白部分用链霉蛋白酶进行消化，将剩余的GAG样品置于用乙酸纤维素制成的薄膜上和标样硫酸软骨素(Ch6S)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粗蛋白聚糖的提取方法，其特征是用酸作为软骨的洗脱溶剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高垣啓一，
申请(专利权)人：株式会社角弘，高垣啓一，
类型：发明
国别省市：JP[日本]