一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法。本发明专利技术通过在谷氨酸棒杆菌中过表达内源的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因hdpA来强化磷酸二羟基丙酮脱磷酸生成二羟基丙酮，引入外源的甘油脱氢酶将二羟基丙酮转化成甘油，甘油在外源的甘油脱水酶及其激活因子以及醇脱氢酶的作用下最终生成1,3‑丙二醇。谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，还可以使用廉价的玉米浆作为营养成分替代昂贵的酵母粉，可以进一步降低原料的成本，同时解决了生物安全性以及菌株对底物与产物的耐受性问题。同时发酵过程中的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。本发明专利技术方法副产物少，能够进一步简化1,3‑丙二醇的分离过程。

A method of 1,3 propylene glycol using recombinant microorganism fermentation

The present invention provides a method for 1,3 propylene glycol using recombinant microorganism fermentation. The invention in Corynebacterium glutamicum over expression of two hydroxy acetone phosphate phosphatase gene hdpA to strengthen endogenous two hydroxy acetone phosphate phosphoric acid to produce two hydroxy acetone, glycerol dehydrogenase into exogenous two hydroxy acetone into glycerol, glycerol in glycerol dehydratase and exogenous activator and alcohol dehydrogenase under the action of the final generation 1,3 propylene glycol. Corynebacterium glutamicum can be fermented by different cheap raw materials, can also use cheap corn syrup as nutritional yeast powder instead of expensive, can further reduce the cost of raw materials, and solves the problem of biological safety and tolerability of substrate and product of strain. At the same time, the bacteria in the fermentation process can be used as a product and used in feed additives. The method of the invention is less by-products, the separation process can be further simplified 1,3 propylene glycol.

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法
本专利技术属于基因工程和生物发酵
，具体地说，通过单一重组微生物将可发酵糖高效生物转化为1,3-丙二醇的方法。
技术介绍
1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源。因此，化学法生产1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。生物法生产1，3-丙二醇目前主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组微生物生产1，3-丙二醇。具体介绍如下。一种是以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇。自然界存在天然的微生物，如克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)及弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)可以在厌氧或者微氧的条件下将甘油转化为1，3-丙二醇，其代谢途径主要包括两步反应，第一步：甘油在甘油脱水酶的作用下脱水生成3-羟基丙醛，第二步：3-羟基丙醛在1，3-丙二醇脱氢酶的催化下还原成1，3-丙二醇。其中甘油脱水酶由3个亚基构成，其编码基因为dhaBCE(或者dhaB123)。甘油脱水酶在催化甘油脱水的过程中会自动失活，需要在激活因子的作用下重新被激活。甘油脱水酶激活因子的编码基因为dhaG和dhaH。同时自然界中还存在1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子可以催化甘油或者1,2-丙二醇的脱水，其编码基因为pduCDEGH。1，3-丙二醇脱氢酶是一个NADH依赖的醇脱氢酶，其编码基因为dhaT。其他一些醇脱氢酶如大肠杆菌里yqhD基因编码的NADPH依赖的醇脱氢酶也可以催化3-羟基丙醛还原生产1，3-丙二醇。甘油在还原生成1，3-丙二醇的过程，需要消耗还原力NADH或者NADPH，这些还原力是通过甘油氧化成其他副产物如乙酸、乳酸，2，3-丁二醇等产生的。目前，工业上利用甘油生产1，3-丙二醇的工艺主要采用克雷伯氏肺炎杆菌(如中国专利CN200810105722.8)。这个工艺路线的主要缺点是：一、克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；二、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；三、1，3-丙二醇的得率低，通常1，3-丙二醇对甘油的质量得率低于40％。现有技术中还有一种是以葡萄糖为原料利用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇的方法。自然界不存在可以直接转化葡萄糖生成1，3-丙二醇的微生物。杜邦公司通过在大肠杆菌内外源表达来自酿酒酵母的甘油合成途径(甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸酶)和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化(CN200380104657.2)。这一工艺路线的缺点是大肠杆菌是生物安全性较差，大肠杆菌的发酵培养需要使用昂贵的原料酵母粉，因此该技术不利于产业化规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物安全度高、产量高、操作简便且成本低廉的利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，以克服现有技术的不足。本专利技术提出的1,3-丙二醇合成途径如图1所示。葡萄糖或者蔗糖等可发酵糖通过糖酵解途径产生磷酸二羟基丙酮，后者在磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶催化下生成二羟基丙酮，后者进一步在甘油脱氢酶的催化下合成成甘油。甘油在甘油脱水酶及醇脱氢酶的作用下最终生成1,3-丙二醇。该途径不同于杜邦公司采用的1,3-丙二醇合成方法，主要区别是杜邦公司通过表达甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸脂酶来合成中间产物甘油，而本专利技术提出的途径可以在不同微生物里实现从葡萄糖到1,3-丙二醇的合成。本专利技术提供的一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：(1)构建能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物；(2)以含可发酵糖的原料为底物进行好氧发酵。本专利技术的方法中，所述重组微生物的构建方法为：1)构建分别能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶和甘油脱氢酶的重组菌或重组质粒；2)构建构建分别能够过表达甘油脱水酶及其激活因子和醇脱氢酶的重组菌或重组质粒；3)将步骤1)获得的重组质粒电转化入步骤2)获得的重组菌中，或将步骤2)获得的重组菌电转化入步骤1)获得的重组菌中，筛选获得能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物。所述的微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。本专利技术利用谷氨酸棒杆菌作为宿主微生物来构建1,3-丙二醇的合成途径。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的微生物，广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸和赖氨酸的生产。利用谷氨酸棒杆菌来发酵生产1,3-丙二醇解决了生物安全性的问题。本专利技术所述磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶来源于谷氨酸棒杆菌，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述甘油脱氢酶来源于大肠杆菌，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，本专利技术的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶hdpA获得方法是：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组为模板，以hdpA-F(cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG)和hdpA-R(CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT)为引物进行PCR，获得hdpA基因(hdpA基因序列如SEQIDNO.1)约0.9kb并进行PCR产物纯化。本专利技术的甘油脱氢酶gldA以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以gldA-F(CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC)和gldA-R(atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC)为引物进行PCR，获得gldA基因(gldA基因序列如SEQIDNO.2)约1.2kb并进行PCR产物纯化。优选地，所述甘油脱水酶及其激活因子，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，甘油脱水酶及其激活因子来源于克雷伯氏肺炎杆菌。在本专利技术的实施例中，甘油脱水酶及其激活因子是以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以pdu-F(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)和pdu-R(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCG)为引物进行PCR，获得包括甘油脱水酶及其激活因子的pduCDEGH操纵子片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物；(2)以含可发酵糖的原料为底物进行好氧发酵。

【技术特征摘要】
1.一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物；(2)以含可发酵糖的原料为底物进行好氧发酵。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组微生物的构建方法为：1)构建分别能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶和甘油脱氢酶的重组菌或重组质粒；2)构建分别能够过表达甘油脱水酶及其激活因子和醇脱氢酶的重组菌或重组质粒；3)将步骤1)获得的重组质粒电转化入步骤2)获得的重组菌中，或将步骤2)获得的重组质粒电转化入步骤1)获得的重组菌中，筛选获得能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。4.如权利要求2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，刘德华，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11