一种重组酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种重组酵母菌株及其应用。本发明专利技术所述重组酵母菌株为发酵生产番茄红素的酵母菌株，并且其ALD6启动子表达强度被下调。本发明专利技术通过对酵母菌株ALD6启动子的深入研究，发现通过全部敲除或以低表达强度启动子替换等下调ALD6启动子表达强度的方式构建生产番茄红素的重组菌株，能够显著该生产菌株的番茄红素产量，可作为今后酵母工程菌合成路径的优化手段，构建出产能更加优异的重组工程菌。

Recombinant yeast strain and application thereof

The invention relates to the technical field of gene engineering, and discloses a recombinant yeast strain and an application thereof. The recombinant yeast strain of the invention is a yeast strain producing lycopene by fermentation, and the expression intensity of the ALD6 promoter is lowered. Through the in-depth study of the yeast ALD6 promoter, found all by knockout or with low expression promoter substitution down-regulation of ALD6 promoter expression intensity of construction production of recombinant strains of tomato red pigment, can significantly the production strains of lycopene production, can be used as the optimization method in the future engineering yeast synthesis the path of construction, to produce more excellent recombinant bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种重组酵母菌株及其应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其应用。
技术介绍
在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新潮流，具有广阔的市场前景。番茄红素是一种脂溶性天然食用色素，在化学结构上属于类胡萝卜素，具备极强的抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研究的热点。番茄红素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有其自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。目前，在微生物合成番茄红素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒酵母。酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。因此，实现番茄红素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。酿酒酵母和番茄红素合成路径间的适配是目前研究的主要方向。一方面异源生物合成路径本身的代谢通量决定目标产物的产量，因此需要优化异源路径，包括优化异源基因的表达、基因来源的筛选、胞内前体物质供给等；另一方面来自宿主细胞固有的代谢和调控系统也会影响目标生物合成路径的生产能力，这就需要对底盘细胞进行深入系统的优化。在酿酒酵母中，基因ALD6(由ALD6启动子控制)编码乙醛脱氢酶，催化细胞质中的乙醛生成乙酸。基因ALD6的表达水平会直接影响细胞中乙酸的积累，但尚未有任何该基因可影响番茄红素产量的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得该重组菌株在用于发酵生产番茄红素时能够提高产量，可以应用到相关番茄红素制备领域中。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种重组酵母菌株，该菌株为发酵生产番茄红素的酵母菌株，并且其ALD6启动子表达强度被下调。目前酵母菌株ALD6启动子功能的研究仅局限在乙酸积累方面，而其他方面的功能并未有相关报道，本专利技术针对目前现状，从多方面对ALD6启动子进行研究，发现ALD6启动子表达强度下调能够增加生产番茄红素的酵母菌株的产量。本专利技术所述所述ALD6启动子表达强度被下调为直接敲除ALD6启动子或采用表达强度低于ALD6启动子的其他启动子替换。在本专利技术中，表达强度低于ALD6启动子的其他启动子选择为URA3启动子，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。作为优选，本专利技术所述酵母菌株为酿酒酵母，可选自CEN.PK系列酿酒酵母，如酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D或酿酒酵母CEN.PK2，也可选自BY系列酿酒酵母，如BY4741酿酒酵母或BY4742酿酒酵母或BY4743酿酒酵母。酵母菌株本身不具备生产番茄红素的能力，缺少部分酶，需要构建外源基因元件导入其中成为生产菌株。在本专利技术中导入了经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)来源的crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的crtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。上述两个基因片段的构建方式记录在专利CN105087406A中，其中本专利技术基因片段1即为CN105087406A中的基因片段1，而本专利技术基因片段2是在CN105087406A中的基因片段2基础上，采用成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的crtE，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。此外，在本专利技术的具体实施方式中，本专利技术所述重组酵母菌株采用酿酒酵母CEN.PK2-1C，其为四重营养缺陷型(亮氨酸、色氨酸、组氨酸、尿嘧啶)酿酒酵母，利于筛选正确菌株，同时为了保证酿酒酵母不消耗诱导剂半乳糖，本专利技术敲除了酿酒酵母中的gal1、gal7和gal10三个基因，上述的这些对酵母的改动只是为了方便验证试验的进行，对最终效果的实现无影响。采用本专利技术所述重组酿酒酵母进行番茄红素的摇瓶试验，结果显示，在相同的番茄红素生产菌株前提下，直接敲除ALD6启动子或采用较低表达强度的启动子替换的生产菌株，其番茄红素的产量得到显著提高。因此，本专利技术提出了所述重组酵母菌株在制备番茄红素中的应用或在生产以番茄红素为中间产物的产品中的应用。同时，本专利技术提供了一种发酵生产番茄红素的方法，将本专利技术所述重组酵母菌株接种到种子培养基中活化至对数生长中期，然后转接到发酵培养基中发酵生产番茄红素。在具体实施方式中，所述方法为将本专利技术所述重组酵母菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.2转接于新鲜的25mL种子培养基中，于30℃、250rpm条件下培养至对数生长中期，以初始菌体浓度OD600＝0.5分别接种于50mL发酵培养基中，于30℃、250rpm条件下培养，发酵生产番茄红素。其中，所述种子培养基优选为包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨以及10g/L酵母浸粉；所述发酵培养基优选包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉以及10g/LD-半乳糖。由以上技术方案可知，本专利技术通过对酵母菌株ALD6启动子的深入研究，发现通过全部敲除或以低表达强度启动子替换等下调ALD6启动子表达强度的方式构建生产番茄红素的重组菌株，能够显著该生产菌株的番茄红素产量，可作为今后酵母工程菌合成路径的优化手段，构建出产能更加优异的重组工程菌。附图说明图1所示为对照番茄红素生产菌株、敲除ALD6启动子的番茄红素生产菌株、以URA3启动子替换ALD6启动子的番茄红素生产菌株在20g/L葡萄糖培养基中的番茄红素产量；其中，纵坐标为番茄红素产量，横坐标为三种菌株在本专利技术中的编号，从左至右依次对应于对照番茄红素生产菌株、敲除ALD6启动子的番茄红素生产菌株、以URA3启动子替换ALD6启动子的番茄红素生产菌株；图2所示为对照番茄红素生产菌株、敲除ALD6启动子的番茄红素生产菌株、以URA3启动子替换ALD6启动子的番茄红素生产菌株在40g/L葡萄糖培养基中的番茄红素产量；其中，纵坐标为番茄红素产量，横坐标为三种菌株在本专利技术中的编号，从左至右依次对应于对照番茄红素生产菌株、敲除ALD6启动子的番茄红素生产菌株、以URA3启动子替换ALD6启动子的番茄红素生产菌株。具体实施方式本专利技术公开了一种重组酵母菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述菌株和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组酵母菌株，其特征在于，该菌株为发酵生产番茄红素的酵母菌株，并且其ALD6启动子表达强度被下调。

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母菌株，其特征在于，该菌株为发酵生产番茄红素的酵母菌株，并且其ALD6启动子表达强度被下调。2.根据权利要求1所述重组酵母菌株，其特征在于，所述ALD6启动子表达强度被下调为直接敲除ALD6启动子或采用表达强度低于ALD6启动子的其他启动子替换。3.根据权利要求2所述重组酵母菌株，其特征在于，所述其他启动子为URA3启动子。4.根据权利要求1所述重组酵母菌株，其特征在于，包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：酵母trp1位点上游同源序列、CYC1终止子、三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)来源的crtI、GAL10启动子、GAL1启动子、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的crtB、PGK1终止子、酵母trp1位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1；酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACT1终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGR1、GAL10启动子、GAL1启动子、成团泛菌(Pantoeaagglomerans)来源的crtE、GPM1终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段2。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓，陈艳，王颖，肖文海，姚明东，李博，刘宏，元英进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12