高效的不依赖锌离子的磷脂酶C突变体制造技术

本发明专利技术涉及高效的不依赖锌离子的磷脂酶C突变体。具体而言，本发明专利技术提供一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：(1)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。本发明专利技术还涉及编码所述氨基酸序列的多核苷酸序列，含有所述多核苷酸序列的核酸构建体、宿主细胞，含有所述氨基酸序列的组合物，以及所述氨基酸序列的用途。

An efficient phospholipase free C mutant without zinc ions

The present invention relates to efficient phospholipase C mutants that do not rely on zinc ions. Specifically, the invention provides a separation of amino acid sequence, the amino acid sequence contains: (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO:7 shown; or (2) (1) in the amino acid sequence of the through substitution, deletion or addition of one or several amino acids, while retaining the SEQ ID NO:7 with phospholipase C activity by (1) derived peptides. The invention also relates to polynucleotide sequences encoding the amino acid sequence of the nucleic acid containing the polynucleotide sequence constructs, host cells, compositions comprising the amino acid sequence, and the use of the amino acid sequence.

【技术实现步骤摘要】
高效的不依赖锌离子的磷脂酶C突变体
本专利技术涉及高效的不依赖锌离子的磷脂酶C突变体，具体地涉及通过分子生物学中的突变筛选方法获得的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C突变体及其用途。
技术介绍
脱胶是油脂精炼的一个重要步骤，而传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年，很多努力致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节，并取得了很大的进展。同传统方法相比,酶法脱胶能够提高经济效益，做到节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶所用的酶即为磷脂酶。磷脂酶具备水解一个或多个甘油磷脂酯键的能力，它代表着一类脂肪酶、酰基水解酶和磷酸酯酶。磷脂酶根据该酶在磷脂分子上作用位点的不同，可以分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。磷脂酶C(PhospholipaseC，简称PLC)，是一种能够水解甘油磷脂C3位点磷脂酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，比如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，这些酶已经从各种微生物中分离得到，细菌来源的较多包括产气荚膜梭菌Clostridiumperfringens〔YunT,SiebelC.CloningandexpressionofthePLCgenefromClostridiumperfringensandClostridiumbifermentants[J].Infectionandimmunity,1989,2:468-476〕、双酶梭菌C.bifermentans、Burkholderiapseudomallei、Bacilluscereus、蕈状芽孢杆菌Bacillusmycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeriamonocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococusaureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii、链霉菌Streptomycesclavuligerus、伯克氏菌属Burkholderi等等。来自放线菌的有八丈岛链霉菌Streptomyceshachijyoensis等。还有来自酵母菌的白色念珠菌Candiaalbicans〔AnaluzE,Juan-JoseR,RosarioCueva.Sequencingofa4.3kbpregionofchromosome2ofCandidaalbicansrevealsthepresenceofhomologuesofSHE9fromSaccharomycescerevisiaeandofbacterialphosphatidylinostiol-phospholipaseC[J].Yeast,2001,18(8):711-721〕、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae〔PayneW,Fitzgerald-HayesM.AmutationinPLC1,acandidatephosphoinositidespecificphospholipaseCgenefromSaccharomycescerevisiae,causesaberrantmitoticchromosomesegregation[J].MolecularandCellularBiology,1993,13:4351-4364〕等。Bacilluscereus的PC-PLC(BC-PC-PLC)，是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansen,T.、Holm,T.、Guddal,P.H.、Sletten,K.、Haugli,F.B.、Little,C，1988，"Cloningandsequencingofthegeneencodingthephosphatidylcholine-preferringphospholipaseCofBacilluscereus"，Gene65(2)：293-304)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+结合位点(Hough.,E.、Hansen,L.K.、Birknes,B.、Jynge,K.、Hansen,S.、Hordvik,A.、Little,C.、Dodson,E.、Derewenda,Z.，1989，"High-resolution(1.5A)crystalstructureofphospholipaseCfromBacilluscereus"，Nature，338:357-60)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少目前只在Bacillussubtilis和pichiapastoris中进行表达(Durban,M.A.、Silbersack,J.、Schweder,T.、Schauer,F.、Bornscheuer,U.T.，2007，HighlevelexpressionofarecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinBacillussubtilis，ApplMicrobiolBiotechnol74(3):634-639；Seo,K.H、RheeJ.I.，2004，High-levelexpressionofrecombinantphospholipaseCfromBacilluscereusinPichiapastorisanditscharacterization，BiotechnolLett26(19):1475-1479)。目前，磷脂酶C主要应用于酶法脱胶。在制造大豆、菜籽等食用油时，未经精炼的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属以及其它微量化合物的复杂混合物。其中磷脂会造成色泽及口味变差、保质期变短并且影响后续的精炼效果。目前，主要的脱胶方式有水化脱胶、深度脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶由于条件温和、无污染、油耗低，越来越受到人们的青睐。由于磷脂酶C作用于甘油磷脂可以生成甘油二酯，因此，在酶法脱胶过程中使用磷脂酶C可以显著提升油脂的得率，从而提高生产经济效益。因此，提升磷脂酶C的脱胶性能具有非常重要的生产实践意义。但本领域仍然需要具有更高酶活的BC-PC-PLC。
技术实现思路
本专利技术人通过将BC-PC-PLC的三个糖基化位点即63位，131位和134位天冬酰胺分别突变为天冬氨酸，丝氨酸和天冬氨酸(见SEQIDNO：2)，在低硫酸锌条件下其酶活相比于野生型提高16倍。进一步地，本专利技术人利用易错PCR(error-ponePCR)得到SEQIDNO：2的突变体文库，将突变体文库中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：(1)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：7所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：(1)SEQIDNO：7所示的氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQIDNO：7所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。2.如权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，SEQIDNO：7中第56位的氨基酸Xaa为丙氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸或色氨酸，优选组氨酸或色氨酸；和/或(2)所述的取代、缺失或添加一个或几个氨基酸为第106位的M突变为V；优选地，(2)所述的氨基酸序列56位的氨基酸残基为组氨酸，106位的氨基酸残基为缬氨酸；和/或所述氨基酸序列含有前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签、和/或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。3.如权利要求1所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:2、4和6。4.一种分离的多核苷酸序列，选自：(1)编码权利要求1-3中任一项所述的分离的氨基酸序列的多核苷酸序列；(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段；优选地，所述多核苷酸序列如SEQIDNO:1、3或5所示。5.一种核酸构建体，其特征在于，该核酸构建体包含权利要求6所述的多核苷酸序列，优选地，所述核...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，刘莎，顾思天，包悦佚，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31