本发明专利技术涉及单价、二价和多价多肽结合复合体以及单特异性、双特异性或多特异性多肽结合复合体的制备及其用途。本发明专利技术还涉及得自噬菌体展示文库、转基因动物或天然来源的抗原特异性ＶＨ结合结构域的多样性库（ｄｉｖｅｒｓｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）的制备和用途。优选ＶＨ结合结构域和二聚化结构域包含人序列。所述多肽结合复合体包含具有４个抗原结合［ＶＨ］结构域并且优选用天然铰链或接头肽在二聚化结构域氨基端和羧基端融合的同二聚化结构域或异二聚化结构域。在所述多肽结合复合体缺乏Ｃ↓［Ｈ］２－Ｃ↓［Ｈ］３效应子功能的情况下，其大小优选不超过１２０ｋＤａ。制备路线见说明书。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含连接到二聚化结构域(dimerisation domain)氨基 端和羧基端两端的VH结合结构域(如本文定义)的多肽结合复合体 (polypeptide binding complex)的制备方法。用本专利技术方法制备的VH结 合结构域和二聚化结构域相对于现有技术所述scFv衍生的多肽结合 复合体，具有内在结构和功能的稳定性，因此为产品制造和产品稳定 性提供了优势。本专利技术还描述了其用途。
技术介绍
单克隆抗体或其变异体将在21世纪新药的投放中占较大的比例。 单克隆抗体疗法已被公认是用于治疗类风湿性关节炎和克罗恩病 (Crohn's disease)的优选途径，并且在癌症治疗中取得了重大进展。用 于治疗心血管疾病和传染病的基于抗体的产品也在开发之中。大多数 市售的单克隆抗体产品识别并结合靶配体(例如TNFa)上的单个定义明确的表位。装配包括两条重链和两条轻链的复合体(H2L2复合体)，以及随后的翻译后糖基化过程需要利用哺乳动物生产系统。通过哺乳 动物细胞培养制造抗体的生产成本和资金成本高昂，而且在缺乏可接 受的替代方法时，有限制基于抗体的疗法潜力的风险。多种转基因生 物能够表达全功能性抗体，包括植物、昆虫、鸡、山羊和牛。可在大 肠杆菌(五.co/Z)中生产功能性抗体片段，但是除非在制造过程中进行聚 乙二醇化，否则产品的血清稳定性通常较低。双特异性抗体复合体是基于工程Ig的能够结合相同或不同抗原 上两种不同表位的分子。双特异性结合蛋白单独或与其它结合剂联用 掺入抗体，从中获得的人免疫功能而产生治疗效果，显示出是有前景的治疗模式，例如清除病原体(Van Spriel等，(1999) / /"/e". Z^eoses, 179， 661-669; Tacken等，(2004) J /www"o/" 172, 4934-4940; US 5,487,890)、治疗癌症(Glennie和van der Winkel, (2003」Z^"g"^coi^y 7b&y, 8, 503-5100)和免疫疗法(Van Spriel等，(2000)/mww"o/. 7bc/"乂 21， 391-397; Segal等，(2001) J /w附w"o/. M"/zo成248， 1-6; Lyden等， (2001)舰MW.， 7, 1194-1201)。制造方面问题的复杂性在于双特异性抗体产物以两种或更多种 H2L2复合体为^出。例如两套或更多套重链和轻链基因的共同表达可 导致形成高达10种不同的组合，其中仅有一种为所需的异二聚体 (Suresh等，(1986) M"/20A ￡"z_ymo/.， 121, 210-228)。为解决这一问题，开发了许多方法以用哺乳动物细胞生产保留重 链效应子功能(effector ftmction)的全长双特异性IgG形式(BsIgG)。 BsIgG需要工程改造的"杵臼结构(knob and hole)"重链以防止异二聚 体形成，并且利用相同L-链来避免L-链错配(Carter， (2001) / /wmw"o/. MW/7o&， 248， 7-15)。还有研究描述了备选的化学交联方法，用以由各 个识别不同抗原的抗体片段制备复合体(Ferguson等，(1995) Arthritis and Rheumatism, 38, 190-209),或者将其它结合蛋白(例如胶原凝集素) 与抗体片段交联来制备复合体(Tacken等，(2004) / /www"o/., 172, 4934-4940)。开发通常缺乏重链效应子功能的双链抗体(diabodies)或微型抗体 (mini antibodies) (BsAb)也克服了异二聚体丰余性(hetero-dimer redundancy)。这些包含掺有Vh和VL结合位点的最小单链抗体(scFv)， 最小单链抗体随后折叠并二聚化从而形成对其每个靶抗原都是单价 的二价双特异性抗体(Holliger等，(1993) 90， 6444-6448; Muller等，(1998) F5^SZe"., 422, 259-264)。在一个实例中，ChI和L-恒定区 结构域用作形成双特异性微型抗体的异二聚化结构域 (heterodimerisation domain) (Muller等，(1998) i^^SZe".， 259-264)。已 经开发出许多基于大肠杆菌表达系统的重组方法以生产BsAb6(Hudson, (1999) Ci#r. C^'". /w附w"o/., 11， 548-557)，尽管生产临床级多 价抗体材料的费用和规模似乎仍然是其临床开发的主要障碍(Segal等， (2001)J /謂画/.齒/zo成248, 1-6)。近来，BsAb概念已经延伸到包括双-双链抗体(di-diabodies)、四 价双特异性抗体(tetravalent bi-specific antibodies),其中在各H链和L 链上的VH结构域和Vt结构域已经被scFv结合结构域的工程对 (engineered pairs)置换。虽然这类构建体的工程改造十分复杂，但是仍 可在哺乳动物的培养细胞中进行装配而不出现异二聚体丰余性(Lu等, (2003) /仿wwwo/. MeAoA, 279， 219-232)。免疫球蛋白的结构是本领域众所周知的。大多数天然免疫球蛋白 包含两条重链和两条轻链。重链通过大约位于每条重链中部的铰链区 之间的二硫键互相结合。轻链在铰链区的N端一侧上与每条重链结 合。每条轻链通过铰链区附近的二硫键正常结合到其各自的重链上。当Ig分子正确折叠时，每条链折叠成多个由更线性多肽序列结 合的特殊球状区。例如轻链折叠成可变区(Vt)和恒定区(CiJ。重链有 邻近轻链可变区的单个可变区VH、第一恒定区、铰链区和两个或三个 另外的恒定区。重链(VH)和轻链(VO可变区的相互作用导致抗原结合 区(Fv)形成。通常Vh和Vt都需要最佳的抗原结合，尽管重链二聚体 和氨基端片段在没有轻链时仍显示保持活性(Jaton等，(1968) 所0c/2麵勿，7， 4185-4195)。随着新的分子生物学技术的出现，在人B细胞增殖性疾病(重链 疾病)和鼠模型系统中鉴定出存在仅有重链的抗体(缺乏轻链)。重链疾 病的分子水平分析显示，基因组水平上的突变和缺失可导致重链CH1 结构域不当表达，引起缺乏结合轻链能力的仅有重链的抗体进行表达 (参见Hendershot等，(1987)丄CW/ 104， 761-767; Brandt等，(1984) Mo/. CW/. B/o/.， 4， 1270-1277)。对得自噬菌体文库的分离的人VH结构域进行的独立研究(Ward 等，(1989)Atowre, 341, 544-546)证实了 VH结构域的抗原特异性结合，但是这些VH结构域一般但不总是被证明具有相对低的溶解度(参见 Jespers等，(2004) J. Mol. Biol. 337, 893-903)。使用其它脊推动物物种的研究显示，作为天然基因突变的结果， 骆驼(camelid)产生功能性仅有IgG2和IgG3重链的二聚体，由于缺乏 CH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽结合复合体，包含第一多肽链和第二多肽链的二聚体，其中每条多肽链都包含氨基端ＶＨ结合结构域、羧基端ＶＨ结合结构域和二聚化结构域，其中二聚化结构域缺乏ＣＨ↓［２］－Ｃ↓［Ｈ］３功能。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：D德拉贝克，FG格罗斯维尔德，RK克雷格，RW扬森斯，
申请(专利权)人：伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]
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