表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途。本发明专利技术提供含有内源λ轻链基因座、内源κ轻链基因座和内源重链基因座的非人哺乳动物，每个基因座可重排使得在抗原攻击后在B细胞中形成并表达免疫球蛋白重链和轻链基因，但是所述基因座已经突变使得形成包含从所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力大大降低或消除。

【技术实现步骤摘要】
表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途本申请为分案申请，原申请的申请日为2009年11月30日，申请号为200980151815.7(PCT/GB2009/002781)，专利技术名称为“表达人源化抗体的非人转基因动物及其用途”。专利
本专利技术涉及使用转基因非人哺乳动物响应抗原攻击而衍生和选择各种功能性亲和力成熟四聚体免疫球蛋白(包含重链和轻链)库的改进方法及其用途。具体地讲，本专利技术涉及经过工程改造使得其产生小鼠内源κ和/或λ轻链免疫球蛋白的能力大大降低或者轻链与重链复合的能力降低、消除或被阻断的非人哺乳动物，优选小鼠。本专利技术的非人哺乳动物产生小鼠功能性内源重链的能力也下降。因此，其形成包含由所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力已大大降低或消除。本专利技术还披露了产生这类哺乳动物的方法以及利用这类哺乳动物使用免疫球蛋白重链和轻链转基因产生人四聚体抗体和杂交四聚体抗体的方法。在下面的说明中，所有氨基酸残基的位置号根据由Kabat等人((1991)，美国公共卫生署(USPublicHealthServices)出版物第91-3242号)设计的编号系统给出。专利技术背景抗体抗体的结构是本领域众所周知的。大多数天然抗体是四聚体，包含2条重链和2条轻链。重链通过大致位于每条重链中部的铰链结构域之间的二硫键彼此连接。轻链在铰链结构域的N端侧与各重链缔合。每条轻链通常通过接近铰链结构域的二硫键与其对应的重链结合。当抗体分子正确折叠时，每条链折叠成许多通过较为线性的多肽序列连接的独特的球状结构域。例如，轻链折叠成可变(VL)结构域和恒定(Cκ或Cλ)结构域。重链具有单个可变结构域VH、第一恒定结构域(CH1)、铰链结构域和两个或三个另外的恒定结构域。重链的恒定结构域和铰链结构域一起形成通常所称的抗体重链恒定区。重(VH)链和轻(VL)链可变结构域的相互作用导致形成抗原结合区(Fv)。重链的CH1结构域和轻链的Cκ或Cλ结构域有利于重链和轻链的相互作用。一般而言，抗原结合既需要VH又需要VL，但研究已表明重链二聚体和氨基端片段在轻链不存在时保持活性(Jaton等(1968)Biochemistry，7，4185-4195)。通常循环λ轻链的比例低下，可能占血浆中复合成四聚体免疫球蛋白的全部轻链的2-5％(Goldsby等(2003)Immunology，第5版，W.H.Freeman&CoNY)。体外操纵重链免疫球蛋白基因以构建新的抗体最早披露于二十世纪八十年代。大多数早期抗体工程研究使用针对充分表征的抗原产生的重排小鼠免疫球蛋白μ基因(IgM)。该抗体的特征是已知存在于VH结构域的抗原结合特异性，因为不相关轻链的装配和分泌显示保持抗原结合(Neuberger和Williams(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.,A317,425-432)。使用该系统显示，可使用小鼠抗原特异性VH结合结构域获得包含与小鼠抗原特异性VH结构域融合的人ε恒定效应子区的新抗体。所得杂交IgE保持抗原特异性，并显示IgE的预期效应子活性(Neuberger等(1985)Nature，314，268-270)。重链工程的其它文献实例包括：编码保持抗磷酸胆碱活性的小鼠VH人/IgA或IgG抗体融合体的杂交小鼠-人抗体基因(Morrison等(1984)PNAS，81，6851-6855)；包含小鼠VH和人IgG(γ3)恒定区的抗癌相关抗原17-1A抗体(Sun等(1987)PNAS，84，214-218)；以及包含人IgG(γ1)恒定区和小鼠VH结构域的抗人T细胞抗体(抗CD7)(参见Heinrich等(1989)J.Immunol.，143，3589-97)。正常人B细胞在14号染色体上含有单个免疫球蛋白重链基因座，通过重排从中产生编码重链的基因。在小鼠中，重链基因座位于12号染色体上。正常的重链基因座包含多个V基因区段、许多D基因区段和许多J基因区段。大多数VH结构域由V基因区段编码，但是每个VH结构域的C末端由D基因区段和J基因区段编码。VDJ在B细胞中重排，接着亲和力成熟，为每个VH结构域提供其抗原结合特异性。对从包含单个V区段的重链免疫球蛋白得到的正常H2L2四聚体进行的序列分析表明，响应抗原攻击的多样性主要由VDJ重排和体细胞高变的组合引起(Xu和Davies(2000)Immunity，13，37-45)。超过50个的人V基因区段存在于人基因组中，其中只有39个具有功能。在正常的二倍体产抗体B细胞中，各细胞从一组重链和轻链抗体基因座产生抗体四聚体(H2L2)。由于称为等位基因排斥的过程所致，另一组基因座的使用是非生产性的(Singh等(2003)J.Exp.Med.，197，743-750及其中的参考文献)。现可从响应抗原攻击的转基因小鼠中得到全人抗体(H2L2)。这类转基因小鼠一般包含单个人重链免疫球蛋白基因座和分离的人轻链免疫球蛋白基因座。相应的内源小鼠重链、κ轻链和任选λ轻链基因座编码序列缺失或部分缺失。因此，在低本底的包含人重链和小鼠λ轻链的小鼠/人抗体的情况下只产生包含κ轻链的人抗体(WO90/04036；WO93/12227；WO98/24893；US5877397、US5814318和US6162963)。已实现缺失所有内源鼠重链和轻链免疫球蛋白基因的区段以完全排除内源重链和轻链基因的表达，但技术上的难度仍然存在，特别是如果剔除所有λ轻链编码序列被认为是必需的。已经通过完全缺失所有功能性V和J基因区段以及λ基因座的C1、C2和C3恒定区而达到剔除鼠λ轻链编码序列，产生具有沉默λ轻链基因座的小鼠(参见EP1399559)。一种不同的方法是通过破坏编码鼠重链的基因的膜外显子(membraneexon)来限制小鼠B细胞发育和免疫球蛋白分泌。因此，虽然内源鼠重链基因由于在响应抗原攻击时被转录并进行VDJ重排而具有功能，但是因为IgM从不在前B细胞的细胞表面上表达，所以进一步的发育受到抑制，导致对抗原攻击非生产性的应答(Kitamura等(1991)Nature，350，423-426)，即使内源小鼠κ和λ轻链基因两者仍保持结构完整和功能性也是如此(Tuaillon(2000)MolecularImmunology，37，221-231)。在内源小鼠重链和轻链基因座保持功能的情况下，任何其它引入的免疫球蛋白重链转基因也受等位基因排斥的调节，因此一些B细胞只功能性表达小鼠重链和轻链基因座，而其它B细胞只功能性表达人重链基因座和小鼠轻链基因座(Nussenzweig等(1987)Science，236，816-819)。在任何单个非人转基因动物中存在高度多样化的表达抗体的B细胞群，所述抗体响应不同抗原攻击而来源于可能所有免疫球蛋白基因座。采用已确立的杂交瘤技术，利用HAT选择进行随后的抗原特异性抗体的选择(Davis等(1982)J.Immunol.Methods,50，161-171)无法区分表达一种重链免疫球蛋白基因座的杂交瘤与表达另一种重链免疫球蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生能够产生杂交四聚体抗体的转基因小鼠的方法，所述方法包括：/n使小鼠祖细胞的内源重链基因座、内源λ轻链基因座和内源κ轻链基因座突变，其中所述突变包括将移码突变、多肽编码序列和/或一个或多个终止密码子引入各个基因座中，并且其中在内源重链基因座中的突变为终止密码子的引入；/n由所述祖细胞产生小鼠，其具有显著降低或消除的形成包含从所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力；和/n将异源杂交人/大鼠重链和异源杂交人/大鼠轻链基因座作为转基因通过显微注射引入受精卵中，所述受精卵由所述具有显著降低或消除的形成包含从所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力的小鼠提供，/n其中所述异源重链转基因基因座包含含有一个或多个V基因区段、一个或多个J基因区段和一个或多个D基因区段的人可变区、大鼠恒定区和鼠来源的重链免疫球蛋白LCR，并且/n其中所述异源轻链转基因基因座包含含有异源κ轻链基因座和相关B细胞特异性调节元件的转基因基因座和/或含有λ轻链基因座和相关B细胞特异性调节元件的转基因基因座，并且其中所述异源轻链基因座包含含有一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段的人可变区和大鼠恒定区。/n...

【技术特征摘要】
20081218 GB 0823147.4;20090417 GB 0906673.9;2009051.一种用于产生能够产生杂交四聚体抗体的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
使小鼠祖细胞的内源重链基因座、内源λ轻链基因座和内源κ轻链基因座突变，其中所述突变包括将移码突变、多肽编码序列和/或一个或多个终止密码子引入各个基因座中，并且其中在内源重链基因座中的突变为终止密码子的引入；
由所述祖细胞产生小鼠，其具有显著降低或消除的形成包含从所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力；和
将异源杂交人/大鼠重链和异源杂交人/大鼠轻链基因座作为转基因通过显微注射引入受精卵中，所述受精卵由所述具有显著降低或消除的形成包含从所述突变基因座产生的重排重链和轻链的功能性免疫球蛋白四聚体的能力的小鼠提供，
其中所述异源重链转基因基因座包含含有一个或多个V基因区段、一个或多个J基因区段和一个或多个D基因区段的人可变区、大鼠恒定区和鼠来源的重链免疫球蛋白LCR，并且
其中所述异源轻链转基因基因座包含含有异源κ轻链基因座和相关B细胞特异性调节元件的转基因基因座和/或含有λ轻链基因座和相关B细胞特异性调节元件的转基因基因座，并且其中所述异源轻链基因座包含含有一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段的人可变区和大鼠恒定区。


2.权利要求1的方法，其中引入超过一个不同的转基因重链基因座。


3.权利要求1或2的方法，其中所述祖细胞是胚胎干细胞。


4.前述权利要求中任一项的方法，其中一个或各个异源重链基因座包含4个或更多个V基因区段。


5.权利要求4的方法，其中一个或各个异源重链基因座包含4个大鼠恒定区和4个人VH区段1-46、3-53、3-23和3-11。


6.权利要求4的方法，其中一个或各个异源重链基因座包含18个V基因区段。


7.权利要求6的方法，其中一个或各个异源重链基因座包含5个大鼠恒定区和18个人VH区段6-1、1-2、4-4、2-5、3-07、1-8、4-39、3-15、1-18、3-23、3-30、3-33、3-48、4-34、3-49、3-53、4-59和1-69；任选地，所述18个人VH区段分别位于两个或更多个不同的异源重链基因座；任选地，所述异源重链基因座还包含多个人D区段、多个人J区段以及小鼠来源的LCR。


8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述异源κ轻链基因座包含多个人J区段、小鼠增强子区、大鼠恒定区Cκ和至少5个人Vκ区段4-1、3-11、3-15、3-20和1-39。


9.权利要求8的方法，其中所述异源κ轻链基因座...

【专利技术属性】
技术研发人员：FG格罗斯维尔德，RW詹森斯，MJ范哈佩伦，罗杰·金登·克雷格，
申请(专利权)人：伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心，罗杰·金登·克雷格，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL