肝靶向性高糖密度半乳糖基干扰素偶联物制造技术

［Ｇ－＊－］↓［ｎ］ＮＨ－ＩＮＦ Ｇ为半乳糖分枝桥试剂 Ｘ为Ｏ、ＮＨ ｎ为２－６ ＩＮＦ为干扰素 本发明专利技术提供的是一种高糖密度半乳糖基干扰素偶联物，它是通过分枝桥试剂，使干扰素（ＩＮＦ）分子中的每一个可偶联位点连接上２－５个半乳糖基而形成的偶联物。该偶联物与原药干扰素相比较具有显著的肝靶向性和药理活性，可望开发成为病毒性肝炎的病因性治疗药物，其化学结构通式如上式。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一类通过分枝桥试剂，使干扰素(一种药用蛋白质)分子中每一个可偶联的位点(通常是游离的氨基)连接上2-5个半乳糖基，从而形成高糖密度的半乳糖基干扰素偶联物。在机体内，该偶联物显示出显著的肝靶向特征。通过系统的文献检索和查新，尚未查见本专利技术化学结构类型的半乳糖基干扰素偶联物目前，查见相关的文献和专利报道如下钟裕国等 肝靶向性的半乳糖基干扰素偶联物中国专利技术专利申请公开说明书 申请号9311196公开号CN1087093A公开日1994年5月25日滨口直等 糖基化细胞素中国专利技术专利申请公开说明书 申请号93117879.7开号CN1087916A公开日1994年6月15日管昌田等 半乳糖基干扰素的合成及其肝靶向性研究中华核医学杂志1996，11(2)234钟裕国等 肝靶向半乳糖基干扰素的合成及其生物学性质研究中国药物化学杂志 1995，5(3)164-8钟裕国等 肝靶向半乳糖基细胞色素C的合成及其肝靶向性研究华西医科大学学报1996，27(2)130-3管昌田等 以NGA作为肝靶向药物载体的可行性研究中华核医学杂志1992，12(2)166-8文献，两个专利其半乳糖基干扰素偶联物的结构均为干扰素分子中可偶联位点连接上1个半乳糖基，与本专利技术在结构和功能上均有显著的差异；文献是专利技术人为本专利技术进行的基础研究和方法学研究，未公开发表本专利技术专利的内容。八十年代国外学者证实仅存在于哺乳动物肝细胞膜上的肝结合蛋白(HBP)是无唾液酸糖蛋白的受体(ASGPR)。将人白蛋白用半乳糖基修饰后所得的半乳糖基白蛋白(NGA)，为一人工合成的ASGPR的配体，呈典型的配体——受体识别，并具有配体——受体结合的全部生物学特征，国外将NGA用为肝靶向药物的载体。干扰素是人体内原性细胞素，为一分子量为1.6万左右的活性蛋白，具有抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性，为当今公认的对乙型、丙型病毒性肝炎进行病因性治疗的首选药物。由于注射给药后随血循环自然分布，转运到肝脏的仅有注入剂量的5-7％，要对肝细胞内的肝炎病毒发生药效，要求大剂量(300万单位/天)长时间(三个月)的药物治疗，因而医疗费用高昂，副反应增多，其疗效不够理想(病毒阴转率仅有30％左右)。本专利技术者在国内首次进行了肝靶向干扰素的研究用化学方法，将半乳糖基连接在人白细胞干扰素(INF-α)，基因工程干扰素(rINF α)蛋白分子上，使之具有ASGPR配体和保留INF活性的两重生物学特性。研究结果表明，所制备的半乳糖基干扰素偶联物(Gal-INF-α，Gal-rINF-α1)其肝脏分布率为注入剂量的20-25％，抗病毒活性较未进行半乳糖修饰的原料干扰素提高了2-3倍。这种糖密度为2-3的偶联物，尽管肝靶向性较之原料干扰素已提高了2-3倍，但仍不够理想，从专利技术人的基础研究中获知，如将糖密度提高到8-12，肝脏分布率可望达到30-50％。鉴于干扰素分子中，半乳糖修饰的可结合点(游离氨基)有限，为了提高糖密度，专利技术者设计并合成了可连接多个半乳糖的分枝桥试剂(M1，M2，M3，M4)，并与干扰素(rINFα1，rINF-α2b)进行偶联，通过纯化分离和生物学特性研究实验，所制备的双半乳糖基干扰素(2Gal-rINFα2b，T1)蛋白电泳单带，糖密度＝10，肝脏分布率30-35％。本专利技术的目的在于提供一类连接上2-5个半乳糖的分枝桥试剂与干扰素偶联形成高糖密度的半乳糖基化干扰素偶联物，该偶联物具有显著的肝靶向性。进一步开发成为病毒性肝炎的治疗药物，将会减少干扰素的用药剂量、增强疗效，降低不良反应，节省医疗费用，这对乙型、丙型肝炎的临床治疗，可望取得突破性效果。本专利技术为一种在芳环分枝桥和脂链分枝桥的两端，分别以甙键、肽键、亚氨酯键偶连不同分子数的半乳糖和干扰素而制备的高糖密度半乳糖基干扰素偶联物，该偶联物的化学结构通式如下。 G＝M1，M2，M3，M4X＝O，NHn＝2-6INF＝rINFα2b，rINFα1G为半乳糖分枝桥试剂，其中M1为双糖芳环桥试剂，M2为双糖脂链桥试剂，M3为三糖脂链桥试剂，M4为芳环芳环桥试剂，其化学结构式如下 上述试剂M1，M2，M3，M4分别与r-INFα1、r-INFα2b偶联经纯化后，分别得高糖密度乳糖基干扰素偶联物T1T2T3T4，其化学结构如下 本专利技术目标物的制备方法如下芳环分枝桥类型选合成分枝糖试剂M1，偶联干扰素制备目标物T1为例。双半乳糖芳环分枝桥试剂M1的合成用3，5-二羟基苯甲酸为起始原料与6-氨基己酸甲酯缩合，得3，5-二羟基苯甲酰甲氧羰基己胺，再用二溴乙烷烃化羟基后与硫代半乳糖试剂结合得M1。双半乳糖芳环桥干扰素偶联物T1的制备将M1用甲醇——甲醇钠溶液水解后，蒸去甲醇，残留物溶于pH＝8的磷酸缓冲溶液中，加入rINFα2b和缩合剂EDC，待缩合反应完成后，将反应液透析至透析外液无糖检出，无菌过滤，冷冻干燥得T1。具体工艺条件及操作过程见实施例1。脂链分枝桥类型选合成分枝糖试剂M2，偶连干扰素制备目标物T2为例。双半乳糖脂链桥试剂M2的合成用丙二酸二乙酯为起始原料，经缩合、环化、脱羧还原、加成、开环、碘代等七步得二碘物，再与硫代半乳糖试剂缩合得M2。双半乳糖脂链桥干扰素偶联物T2的制备将M2置于甲醇——甲醇钠溶液中醇解得亚氨基酯，用氮气挥去甲醇，残留物溶于磷酸缓冲液中，加入rINFα1待缩合反应完成后，将反应液透析至透析外液无糖检出，无菌过滤，冷冻干燥得T2。本专利技术目标物的纯度、糖密度和肝靶向性测检(用目标物T1为例)纯度与糖密度检测采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法对双半乳糖基干扰素偶联物(2Gal-rINFα2b即T1)(图1标示A)和原料rINFα2b(图1标示B)和标准分子量蛋白(图1标示C)进行电泳。结果见电泳图(图1)，结果表明，T1和rINFα1的蛋白电泳均为单带(见A.B)两者电泳迁移率有显著差异，达到纯化要求。糖密度的测算用标准分子量蛋白C作标准曲线，测得T1分子量为18700Da，rINFα2b为15200Da，而M1的分子量为694Da。则每分子T1约含5分子M1(18700-15200/694＝5.04)，而每个M1分子含有两个半乳糖，则T1的糖密度为10。肝靶向性检测将T1和原料rINFα2b分别用放射性同位素131I(氯胺T法)进行核素标记得131I-T1和131I-rINFα2b分别注射入家兔静脉中，用Siermens Basicar r照相机作家兔全身放射显影，各自拍摄收集5-30分钟叠加照片(图2，图3)。图2为原料(131I-rINFα2b)照片，为自然分布的血池显象，其中肝、肾、膀胱的放射显像，清晰可见。附图3为131I-T1象，可明显的看到核素在肝区浓集，肾和膀胱显象微弱。两者对比，可直观的看到T1的肝靶向性。小鼠体内分布实验将T1和rINFα2b分别用125I标记(氯胺T法)，所得的125I-T1和125I-rINFα2b分别注入各组小鼠尾静脉，定时处死小鼠，解剖并完整收集小鼠各脏器，测定各脏器官中的放射量，计算其占注入总放射量的百分率，结果见表1.表2。检测结果表明125I-T15分钟肝分布峰值为36.50±2.54，125I-rINFα2b为11.97±0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝靶向性高糖密度半乳糖基干扰素偶联物，其特征在于芳环分枝桥和脂链分枝桥的两端，分别以甙键、肽键、亚氨酯键偶连２－５个半乳糖和干扰素而生成高糖密度分枝桥干扰素偶联物，其化学结构通式如后。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟裕国，吴勇，管昌田，石和平，
申请(专利权)人：华西医科大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]