用于合成和选择性生物催化修饰肽、肽模拟物和蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于合成肽、肽模拟物和／或蛋白和／或用于选择性Ｎ－末端修饰肽、肽模拟物和／或蛋白的方法。该方法包括以下步骤：ａ）制备包含至少一个氨基酸的氨基组分，ｂ）制备包含羧基上的一个离去基团的羧基组分，该羧基组分是包含至少一个氨基酸的化合物或包含至少一个标记基团或报道基团的化合物，和ｃ）使氨基组分和羧基组分在包含至少一种或多种离子性液体的反应介质中，在蛋白酶、肽酶和／或水解酶存在下反应，其中在氨基组分和羧基组分之间形成肽键，并且分裂离去基团。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种使用离子性液体来酶促合成和/或选择性修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的方法，并涉及离子性液体作为唯一的反应介质或与水和/或有机溶剂组合用于抑制水解和蛋白水解副反应的应用。
技术介绍
合成和选择性修饰肽、肽模拟物和蛋白对于系统研究作为功能基因产物的多肽的结构-功能关系的重要性渐增，并对于新的有效治疗的发现具有重要的贡献(参见H.-D.Jakubke，PeptideChemie undBiologie，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Oxford，1996)。但是，它们的合成或选择性修饰中的重要问题是化学方法缺乏选择性和通用性，底物限制或者在使用酶作为催化剂的情况下发生多种副反应。原则上，肽化学中提出的化学方法可以用于合成肽、肽模拟物和蛋白。但是，这些方法受到许多限制并增加产物的复杂性。虽然平均链长度为50-60个氨基酸的肽可以由固相肽合成直接获得，但是由于每种情况下的偶合产率不是定量的，因此通常进一步的链延长导致蓄积了多数副产物，从而导致合成产率降低，并复杂化或妨碍目标产物的纯化。因此，目前用于合成较长的多肽或蛋白的方法基于合成制备的肽片断的缩合，似乎完全受保护的肽片断的连接仅在例外情况下是可能的，因为通常离析物的溶解度非常低。这些方法，基于在1953年第一次提出的以下概念未受保护的肽片断的化学CN连接的分子支架(T.Wieland等人，Annalen 1953，583，129；M.Brenner等人，Helv.Chim.Acta 1957，40，1497)、胺和硫醇截留的研制方法(D.S.Kemp等人，J.Org.Chem.1975，40，3465；N.Fotouhi等人，J.Org.Chem.1989，54，2803)、天然化学连接(M.Schnlzer，S.B.H.Kent，Science 1992，256，221；P.E.Dawson等人，Science 1994，266，776)或醛方法(C.-F.Lin，J.P.Tam，Proc.Natl Acad.Sci.USA 1994，91，6584)，确定选择性进行，但要求它们实现相当特异性的N-或C-末端氨基酸残基，因而它们的应用存在序列-特异性先决条件。在目前认可的天然化学连接的情况下，用C-末端硫酯部分将合成肽与必须包含N-末端半胱氨酸残基的第二肽或蛋白连接。利用关于蛋白接合的知识，可以将天然化学连接进一步发展成为内含肽介导的蛋白连接(expressed protein ligation，EPL；参见特别是T.W.Muir等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 1998，95，6705；G.J.Cotton等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，1100)，其中羧基组分的硫酯部分来自已与裂解组分内含肽融合和通过硫解裂解形成的重组蛋白。除了需要在氨基组分的N-末端的半胱氨酸残基，进一步的一般缺点在于不能排除的C-末端氨基酸残基的部分差向异构，因为所形成(至少当将硫酚用作催化剂时)的硫酯不仅在酯交换之后，还直接通过所加入的氨基组分的末端α-氨基而受到亲核试剂攻击。催化合成方法给待合成的肽键提供较高的灵活性，虽然至少根据性质仍不知道有关制备的通用的肽连接酶。例如，催化抗体(参见特别是P.G.Schultz，R.A.Lerner，Science 1995，269，1835；G.MacBeath，D.Hilvert，Chem.BioL 1996，3，433；D.B.Smithrub等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，278)表现CN连接酶活性，基于GCN4的卷曲螺旋基元(K.Severin等人，Nature 1997，389，706)或基于由强酸性卷曲螺旋肽(S.Yao，J.Chmielewski，Biopolymers 1999，51，370)组成的肽模板的合成肽连接酶也是如此。所有这些情况对于肽连接酶设计而言其有用的起点是不容置疑的，但它们对于连接要求有特定的先决条件，因此它们的一般适用性受到大大地限制。虽然肽酶的反向催化潜能的利用(参见特别是W.Kullm ann，Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Boca Raton，1987；H.-D.Jakubke，Enzymatic Peptide Synthesis，inThe PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Vol.9，(Eds.S.Udenfriend，3.Meienhofer)，Academic-Press，New York，1987，Chapter 3)总体上在特定的必要条件下提供酶连接肽片断的可能性，但不保证连接的特定肽键的不可逆性，且在其中存在所用肽酶的潜在裂解位点之前不能排除在待连接或终产物的片断中不期望的蛋白水解裂解。虽然不同肽酶如枯草溶菌素的再设计改善肽键形成的催化潜能并还可由要求片断缩合来证明(参见特别是D.Y.Jackson等人，Science 1994，266，243)，但通过这种方式不能消除上述的缺点。虽然关于肽和蛋白片断的CN连接提出的底物模拟物概念(F.Bordusa等人，Angew.Chem.1997，109，2583；ReviewF.Bordusa，Braz.J Med.Biol.Res.2000，72，469)具有不可逆性的优点，它同样要求使用合成、蛋白水解非活性蛋白酶变体以防止待连接的生物聚合物内的竞争性裂解。为了肽、肽模拟物和蛋白的修饰，化学方法(参见T.Imoto，H.Yamada，Chemical Modification，in Protein Function.A PracticalApproach(T.E.Creighton，ed.)pp.247-277，IRL Press，1989；G.E.Means，R.E.Feeney，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1971)在蛋白研究中已起着，并仍然起着重要的作用。尽管NMR技术在过去取得快速进展，它在过去的十年中使全信号排布成为可能，并因此能够阐明至多150-200个氨基酸蛋白(未修饰)的3D结构，但化学修饰仍是一种在溶液中测定三维结构的工具，因为大蛋白不顺从NMR结构分析，且X-射线结构分析要求蛋白结晶，这在很多情况下是不能获得的。由于N-末端α-氨基是优选的选择性修饰的目标，在蛋白和肽中无所不在地存在的赖氨酸基团的ε-氨基不允许任何在N-末端靶向引入标记和报道基团。化学酰化反应用醛或者主要用活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺-或4-硝基苯基酯来完成，但是采用它其它蛋白源氨基酸残基的侧链官能化也可能反应，因此排除选择性Nα-修饰。仅用酶法引入苯基乙酰基作为肽合成范围内的氨基酸保护基，并确定青霉素酰化酶对于天然作用的逆转的特异性(R.Didziapetris等人，FEBS Lett.1991，287，31)，并通过相同的酶再次裂解出来(参见ReviewA.Reidel，H.Waldmann，J.prakt.Chem.1993，335，109)。与这种直接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于合成肽、肽模拟物和／或蛋白和／或用于选择性Ｎ－末端修饰肽、肽模拟物和／或蛋白的方法，包括以下步骤：ａ）提供氨基组分，其中该氨基组分具有至少一个氨基酸，ｂ）提供羧基组分，其中该羧基组分在羧基上具有一个离去基团，该羧基组分是具有至少一个氨基酸的化合物或具有至少一个标记或报道基团的化合物，ｃ）使该氨基组分与该羧基组分在含有一种或多种离子性液体的反应介质中，在蛋白酶、肽酶和／或水解酶存在下反应，其中在氨基组分和羧基组分之间形成肽键，并消除离去基团。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：雷纳鲁道夫，F博尔杜萨，N维霍夫斯基，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[]