肽的O-连接的糖基化制造技术

本发明专利技术提供了包含不存在于野生型肽中的Ｏ－连接的糖基化位点的多肽。本发明专利技术的多肽包括糖缀合物，在所述缀合物中，种类例如可溶于水的聚合物、生物分子的治疗剂通过完整的Ｏ－连接的糖基残基共价地连接至多肽。也提供了制备本发明专利技术的肽的方法和制备含有所述肽的药物组合物的方法，和通过施用足以达到想要的反应的量的本发明专利技术的肽来在哺乳动物中治疗、减轻或预防疾病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及O-连接的糖基化的糖肽，特别是包含在野生型肽中不存在的O-连接的糖基化位点的治疗性肽和肽突变体。产生特定生理反应的糖基化和未糖基化肽的施用在医疗领域是熟知的。例如，纯化的和重组的hGH都用于治疗由于缺乏hGH而引起的病症和疾病，例如，儿童中的侏儒症，干扰素具有已知的抗病毒活性，粒细胞集落刺激因子刺激白细胞的产生。限制治疗性肽的主要因素是在对表达系统进行基因工程改造以表达野生型肽的糖基化模式中固有的困难。如本领域已知的，不恰当或不完全糖基化的肽可具有免疫原性，导致肽的中和和/或导致过敏应答的产生。通过重组产生的糖肽的其他缺陷包括亚最优的潜能和快速的清除速率。解决糖基化肽治疗剂生产中的固有问题的一个方法是在肽表达后在体外对其进行修饰。表达后体外修饰已用于修饰多糖结构和在新位点上引入聚糖。已经可以获得重组真核生物糖基转移酶的综合工具箱，这使得可能在体外酶促合成具这样的哺乳动物糖缀合物，即其具有按定制设计的糖基化模式和糖基结构。参见，例如美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577和WO/9831826；US2003180835和WO 03/031464。除了控制多肽上糖基的结构外，还可用一种或多种非糖修饰性基团，例如可溶于水的聚合物制备糖肽。已被缀合至肽上的示例性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。已证明使用PEG衍生肽治疗剂可降低肽的免疫原性。例如，美国专利号4,179,337(Davis等人)公开了无免疫原性的多肽例如和聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。除了减少免疫原性外，由于所述多肽的PEG缀合物的大小增加，延长了其在循环中的清除时间。PEG和其衍生物附着至多肽的基本模式是通过肽氨基酸残基的非特异性键合(参见例如，美国专利号4,088,538、美国专利号4,496,689、美国专利号4,414,147、美国专利号4,055,635和PCT WO87/00056)。将PEG附着至肽的另外的模式是通过糖肽上的糖基残基的非特异性氧化(参见例如，WO94/05332)。在这些非特异性的方法中，以随机、非特异性的方式将聚(乙二醇)加到肽主链上的反应性残基上。当然，PEG分子的随机加入具有其缺点，包括缺少终产物的均一性，和可能降低肽的生物学或酶活性。因此，为了产生治疗性肽，导致特异性标记、可容易地表征、基本上均一的产物的形成的衍生策略是优选的。可通过酶的作用在体外产生特异性标记、均一的肽治疗剂。和将合成的聚合物或其他标记物附着至肽上的典型的非特异性方法不同，基于酶的合成法具有区域选择性和立体选择性的有利方面。用于被标记的肽的合成的两种主要类型的酶是糖基转移酶(例如，唾酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖氨基转移酶)和糖苷酶。这些酶可用于糖的特异性附着，所述糖随后可被修饰，从而包含治疗性部分。可选择地，糖基转移酶和经修饰的糖苷酶可直接用于将经修饰的糖转移至肽主链(参见例如，美国专利6,399,336、美国专利申请公开号20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，其各在此引用作为参考)。将化学和酶促合成的组分结合的方法也是已知的(参见例如，Yamamoto等人Carbohydr.Res.305415-422(1998)和美国专利申请公开号20040137557，其在此引用作为参考)。以几种方法将糖附着至糖肽上，在所述方法中，通过N连接的天冬酰胺和粘蛋白型的O连接的丝氨酸和苏氨酸是与重组糖蛋白治疗剂最密切相关的。不巧的是，并非所有的多肽都包含作为其一级氨基酸序列的部分的N或O-连接的糖基化位点。在其他情况下，已存在的糖基化位点可能不便于将修饰性基团(例如，水溶性或不溶于水的聚合物，治疗性部分(moiety)和/或生物分子)附着至多肽，或这些部分在该位点的附着可导致多肽生物学活性的不想要的降低。因此，在本领域存在对这样的方法的需要，即其允许糖基化位点的精确生成和精确地指导这些位点的修饰的能力。专利技术概述本专利技术发现酶促糖缀合反应可被特异性地靶向O-连接的糖基化位点和附着至O-连接的糖基化位点的糖基残基。被靶向的O连接的糖基化位点可以是野生型肽的天然位点，或可选择地，可通过突变将其导入肽。因此，本专利技术提供了包含适合O-连接的糖基化的突变位点的多肽和其药物组合物。此外，本专利技术提供了制备这些多肽和使用这些多肽和/或其药物组合物进行治疗的方法。因此，在第一方面，本专利技术提供了包含突变的肽序列的分离的多肽，其中所述突变的肽序列编码不存在于对应的野生型多肽中的O-连接的糖基化位点。在一个实施方案中，所述分离的多肽是G-CSF多肽。在一个实施方案中，G-CSF多肽包含具有式M1XnTPLGP或M1B0PZmXnTPLGP的突变的肽序列。在该实施方案中，上标文字1表示野生型G-CSF序列(SEQ ID NO3)的氨基酸序列的第一个位置，下标n和m是选自0至3的整数，而X和B中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，并且当X和B中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分本身是独立地选择的。也是在该实施方案中，Z选自谷氨酸，任何不带电荷的氨基酸或二肽组合，包括MQ、GQ和MV。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自MVTPLGP、MQTPLGP、MIATPLGP、MATPLGP、MPTQGAMPLGP、MVQTPLGP、MQSTPLGP、MGQTPLGP、MAPTSSSPLGP、和MAPTPLGPA的突变的肽序列。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式M1TPXBOrP的突变的肽序列。在该实施方案中上标1表示野生型G-CSF序列的氨基酸序列(SEQ ID NO3)的第一个位置，下标r是选自0至3的整数，X、B和O中的至少一个是苏氨酸或丝氨酸，当X、B和O中超过一个是苏氨酸或丝氨酸时，这些部分的身份(identity)是独立选择的。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自MTPTLGP、MTPTQLGP、MTPTSLGP、MTPTQGP、MTPTSSP、M1TPQTP、M1TPTGP、M1TPLTP、M1TPNTGP、MTPLGP、M1TPVTP、M1TPMVTP和MT1P2TQGL3G4P5A6S7的突变的肽序列。在其他实施方案中，G-CSF多肽包含具有式LGX53BoLGI的突变的肽序列，其中上标表示野生型G-CSF氨基酸序列中氨基酸的位置，X是组氨酸、丝氨酸、精氨酸、谷氨酸或酪氨酸，B是苏氨酸或丝氨酸，O是0至3的整数。在其他实施方案中，G-CSF多肽包含选自LGHTLGI、LGSSLGI、LGYSLGI、LGESLGI和LGSTLGI的突变的肽序列。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含具有式P129ZmJqOrXnPT的突变的肽序列，其中上标表示野生型G-CSF氨基酸序列中氨基酸的位置，Z、J、O和X独立地选自苏氨酸或丝氨酸，m、q、r和n是独立地选自0至3的整数。在另外的实施方案中，G-CSF多肽包含选自P129ATQPT、P129TLGPT、P129TQGPT、P129TSSPT、P129TQGAPT、P129NTGPT、PALQPTQT、P129ALTPT、P129MVTP本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含突变型肽序列的分离的多肽，其中所述突变型肽序列编码不存在于对应于所述分离的多肽的野生型多肽中的Ｏ－连接的糖基化位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S德弗里斯，DA佐夫，ZG王，H克劳森，
申请(专利权)人：尼奥斯技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]