一种活性单肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及血管紧张素Ｉ转换酶抑制肽以及它的类似物，或者其盐类中的一种所构成的ＡＣＥ抑制剂，具体地说是一种从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的活性单肽及其应用，其具有序列表ＮＯ．１的氨基酸序列。本发明专利技术应用现代酶催化技术对牡蛎可溶蛋白进行酶解，利用生物分子分离技术对具有ＡＣＥ抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的单肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在体内、体外对ＡＣＥ的抑制活性及稳定性，结果表明此肽有较强的降血压效果。因此，可以将此活性肽及其衍生物或者其盐类作为高血压患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及血管紧张素I转换酶抑制肽以及它的类似物，或者其盐类中的一种所构成的ACE抑制剂，具体地说是一种从牡蛎可溶蛋白酶解产物 中分离得到的活性单肽及其应用。技术背景高血压是最常见的心血管疾病之一，长期的高血压能引起动脉硬化、 心绞痛、心肌梗塞、终末期肾病等多种疾病，严重威胁着全世界15 — 20% 的成年人的身体健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准， 延长寿命有着重要的意义。血管紧张素I转换酶(angiotensin I converting enzyme,略称为ACE)是 一种Zn2+依赖型二肽外切肽酶，在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶 -激肽系统中，对血压调节起着重要的作用。ACE可以将血管紧张素I转换 为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收縮，同时刺激醛固酮分泌， 促进人体肾脏对Na+、 K—的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血H;:升 高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。因此ACE抑制剂的研究是开 发高血压药物的热点。现有的作为治疗高血压的合成物如卡普托利、爱诺普利等ACE的抑 制剂均具有很多副作用，而源于食品蛋白的ACE抑制活性肽无毒副作用， 市场前景好。曾经有人从牛的脊髓中分离纯化得到与本文所提到的序列相同的九肽 (见5/oc/2em/cfl/ Sfop/2j^s7'ca/ i asearc/7 Commww/caf/ow51， Volume 202, Issue 1， 15 My 1994， Pages 410-415)，并研究讨论了此九肽的阿片活性，然而， 对于此活性单肽的ACE抑制活性至今尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化 的活性单肽及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种活性单肽，其具有序列表NO.l的氨基酸序列。所述的活性单肽及其盐类，它们具有ACE抑制活性，可在制备治疗和预 防高血压药物中的应用；本专利技术相关的ACE抑制剂，使用量是没有特别的限制，具体的要报据 高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素，适"1 地确定。所述药物可为活性单肽及其盐类与充填剂所形成的各种形式的散剂、颗 粒剂、片剂、胶囊、水溶液、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂，通过U腔摄取或者是注射液的形式使用；其使用可以采取经口腔和非经口腔的投入方 法非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，肛肠投入等；注射液的制 作可以任意选用生理盐水、葡萄糖、安定剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂等。 所述药物可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品。食品的形 态可以是液体的，比如像清凉饮料、乳酸饮料、调味品、汤类、同体的奶 酪、火腿、点心等。所述活性单肽及其盐类是从牡蛎可溶蛋白中分离得到的。 将新鲜牡蛎去壳，除内脏，将白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态 下切碎后，将其加到等体积的PBS(0.2 mol/L NaH2P04和0.2 mol/L Na2HP04 按体积比39: 61混合，pH7.0)缓冲液中，充分搅拌。于4。C条件下，静 置6小时后，离心(5000Xg， 4°C) 25分钟。取上清液，加入硫酸铵，并 使其最终浓度达到75%，并在4。C条件下，静置6小时，离心(5000Xg， 4°C) 25分钟。将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW 10000)。流水透析 24小吋,再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡 蛎可溶蛋白。牡蛎可溶蛋白经胃蛋白酶酶解24小时后，酶解产物经超滤(取 分子量小于10000道尔顿的组分)后，采用SephadexLH-20，流动相为30% 的甲醇，柱温为室温，检测波长为280nm，按时间收集。经Sephadex LH-20 分离后得到的具有ACE抑制活性的组分在经C,8高效液相色谱分离纯化，分离条件为流动相A液为含O.P/。TFA的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为:100X的乙腈，检测波长215nm，室温，进样体积20^1，采川梯 度洗脱，按时间收集。洗脱梯度0-40minA液100%-0%线性降低；B液0%-100%线性升高， 40-50min A液0 %; B液100 % 。从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的活性单肽，高效液相-电喷雾串联 质谱(HPLC-ESI-MS)测定此活性肽的分子量为1195道尔顿，经氨基酸测 序仪检测(Model 491, Applied Biosystems, USA)其氨基酸序列为缬氨酸-缬 氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苯丙氛酸 (Val-Val-Tyr-Pro- Trp-Thr-Gln-Arg-Phe; VVYPWTQRF)。本专利技术通过对牡蛎 可溶蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了其氨基酸序列为VVYPWTQRF 的肽，是有效的ACE抑制剂。检测了人工合成的VVYPWTQRF对ACE抑 制活性，证明它对ACE具有较强的抑制作用。上述肽及肽的类似物的盐类可以用通常的方法生产。公认的与酸反应产 生的盐类，比如说盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；蚁酸、乙酸、W酸、 甘氨胆酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公 认的与金属离子形成的盐类，包括钠盐、钾盐、钙盐、铰盐；以及氨基乙 醇、二乙氨、二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。本专利技术应用现代酶催化技术对牡蛎可溶蛋白进行酶解，利用生物分子分 离技术对具有ACE抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的单肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在体内、体外对ACE抑制活性的稳定 性，结果表明此肽有较强的降血压效果。 附图说明图1为Sephadex LH-20柱分离酶解产物液相图谱； 图2为用RP-HPLC Hypersil C18柱分离寡肽图谱； 图3为纯化的九肽浓度与ACE抑制活性关系曲线。具体实施方式卜'面结合实施例对本专利技术作进一步的阐述 实施例l 牡蛎可溶蛋白的制备将新鲜牡蛎去壳，除内脏。留存的白色蛎肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎。之后，将其加到等体积的PBS (0.2 mol/L NaH2POjn 0.2 mol/LNa2HP04按体积比39: 61混合，pH7.0)中，充分搅拌。于4。C条件 下，静置6小时后，离心(5000Xg， 4°C) 25分钟。取上清液，加入硫酸 铵，使其最终浓度达到75%，并在4。C条件下，静置6小时，离心(5000 Xg， 4°C) 25分钟。将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW 10000)。流 水透析24小时,再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥， 得到牡蛎粗蛋白粉末，-20°(:保存。 实施例2牡蛎可溶蛋白的酶解牡蛎可溶蛋白溶于0.05 mol的礴酸缓冲液中(用lmol/L的HC1调pH 2.0)，蛋白浓度2.5%，酶与底物的比，加入胃蛋白酶，酶与底物的比为l: 50 (质量比)，在37 。C下酶解24小时。所得酶解液加热至100 °C，并保 持10分钟，使蛋白酶失活。之后调节水解液pH为中性，离心(5000Xg， 室温)25分钟，经超滤膜(MW 10000)过滤，透过超滤膜的组分，进行真 空冷冻干燥，为牡蛎寡肽，-20°<:保存。实施例3 牡蛎寡肽的分离由牡蛎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性单肽，其特征在于：其具有序列表ＮＯ．１的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，王佳培，胡建恩，白雪芳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[]