一种改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法技术

本发明专利技术涉及制药领域，具体涉及一种改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法，本发明专利技术所述方法包括：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯；2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉作用下生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸；3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸在含水的有机溶剂中并在EDCI-NHS和N-羟基琥珀酰亚胺作用下与溶于缓冲溶液中的适配子反应生成适配子-雷公藤甲偶合物。本发明专利技术方法减少了副反应的发生、提高了适配子的利用率，使得工艺更加简单、优化、更环保，从而提高了目的产物的产率。

An improved method for the synthesis of triptolide aptamer conjugates

The present invention relates to the field of pharmacy, in particular to an improved triptolide - aptamer conjugates of synthetic methods, the method includes: 1) Triptolide and propiolic acid allyl ester in organic solvent in three under the reaction of 3- butyl phosphonate (14- triptolide oxy) - allyl acrylate; 3- (2) 14- triptolide oxy) - 3- acrylic acid allyl ester in organic solvent in 43 phenyl phosphine palladium and morpholine under (14- triptolide oxy) - acrylic acid (3-); 3 14- triptolide phenoxy) - acrylic acid generation aptamer - triptolide conjugates in water containing organic solvent and in the role of EDCI-NHS and N- hydroxysuccinimide and dissolved in the buffer solution of the aptamer reaction. The method of the invention reduces the occurrence of the side reaction, improves the utilization ratio of the aptamer, makes the process simpler, more optimized and more environment-friendly, thereby improving the yield of the target product.

【技术实现步骤摘要】

本专利涉及医药化工
，具体涉及适配子-雷公藤甲素偶合物合成工艺的优化。
技术介绍
雷公藤甲素(Triptolide，TP)又名雷甲素是从传统中药雷公藤中分离得到的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其为白色晶体，不溶于水，易溶于多种有机溶剂。雷公藤甲素是具有松香烷骨架的二萜化合物，含有三个环氧结构和一个α、β不饱和五元内酯环，雷公藤甲素具有抗炎、免疫抑制、抗生育抗肿瘤等诸多活性，广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和肿瘤等。研究表明，雷公藤甲素是一种广谱肿瘤抑制剂，体外可诱导多种肿瘤细胞的凋亡，包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、胃癌等，体内可抑制肿瘤生长和肿瘤细胞转移，包括血液学肿瘤、恶性肿瘤、实体瘤。雷公藤甲素抗肿瘤活性优于顺铂、阿霉素、紫杉醇等传统的抗癌药物，在极低浓度(2-10ng/ml)下即可有效抑制肿瘤细胞增殖。除此之外，雷公甲素还可对抗肿瘤耐药，并提高肿瘤细胞对其他抗癌药物的敏感性、与化疗药物和电离辐射相结合发挥协同效应。适配子(aptamer)是一类具有治疗作用的寡核苷酸，能与靶蛋白发生特异性、高亲和力的结合，其功能类似单克隆抗体，具有高亲和力和高特异性；由于分子量小，可通过细胞膜进入细胞内，能更方便地富集到体内靶向部位；且在体内半衰期长，稳定性好，对环境温度不敏感，容易保存、合成和修饰，可提高其在临床诊断和治疗中的应用。适配子可直接作为药物治疗疾病，部分适配子在与其对应的靶序列特异结合时，结合位点为蛋白的功能区域，蛋白功能将会被抑制。适配子还可作为药物运输载体，将药物与适配子相连使之具有细胞选择性，避免对正常组织和细胞的毒副作用。已知的适配子例如AS1411、Sgc8c，其中AS1411可与肿瘤细胞表面高表达的核仁素特异性结合，同时膜表面的核仁素又能促进肿瘤细胞对AS1411的大胞饮作用，增加摄取量；Sgc8c是通过以完整细胞为靶的指数富集的配基系统进化技术(cell-SELEX)筛选得到的特异性靶向急性T淋巴细胞白血病的单链DNA适配子，由于其血清稳定性高、特异性强和免疫原性低等优势，Sgc8c作为靶向配体与化疗药物相偶联，在急性T淋巴细胞白血病的治疗上取得了很好的效果。因此可以将雷公藤甲素及其结构修饰物与适配子进行结合以提高雷公藤甲素及其结构修饰物的抗肿瘤生物特性。WO2015/085447公开了雷公藤甲素衍生物及其合成方法，其所得的适配子-雷公藤甲素偶合物为白色粉末状固体，即将适配子与雷公藤甲素通过化学小分子的方式链接而形成的适配子雷公藤甲素偶合物(aptamer-drugconjugate，ADCs)，从而利用适配子介导雷公藤甲素到达特定的器官、组织甚至细胞，与细胞膜上受体结合，引发受体介导的内吞作用，从而提高其在靶组织/靶细胞的浓度。WO2015/085447涉及到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯合成反应时采用了Michael加成反应，如实施案例3涉及到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯合成反应，该反应中使用N-甲基吗啉，可能会在反应过程中引起丙炔酸烯丙酯自身加成。
技术实现思路
针对以上技术情况，本专利技术提供一种改进的适配子-雷公藤甲素偶合物制备方法。本专利技术改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法包括：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯；2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉作用下生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸；3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸在含水的有机溶剂中并在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI-NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺作用下与溶于碱性缓冲溶液中的适配子反应生成适配子-雷公藤甲偶合物。本专利技术方法所述步骤1)中，作为本专利技术实施方案之一，三丁基膦的量为0.1～1.0当量，优选0.2～0.3当量；作为本专利技术实施方案之一，丙炔酸烯丙酯的量为1～2.0当量，优选1.1～1.3当量；作为本专利技术实施方案之一，有机溶剂的量为5～25mL。本专利技术方法所述步骤1)中，作为实施方案之一有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、1，1-二氯乙烷或二甲苯、或它们的任意组合。本专利技术方法所述步骤2)中，作为本专利技术实施方案之一，四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量；作为本专利技术实施方案之一，吗啉的量为2～10当量，优选4～5当量；作为本专利技术实施方案之一，四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量，优选0.1～0.2当量；作为本专利技术实施方案之一，有机溶剂的量为10～40mL。本专利技术方法所述步骤2)中，作为本专利技术实施方案之一，有机溶剂为四氢呋喃、甲苯，1，4二氧六环或二甲基亚砜、或它们的任意组合物。本专利技术方法所述步骤3)中，作为本专利技术实施方案之一，EDCI-NHS的量为1.1～2.0当量，优选为1.1～1.3当量；作为本专利技术实施方案之一，N-羟基琥珀酰亚胺的量为1.1～2.0当量，优选为1.1～1.3当量；有机溶剂的量为2～5mL，作为本专利技术实施方案之一，水的量为0.7～1.4mL；作为本专利技术实施方案之一，碱性缓冲溶液为1～4mL；作为实施方案之一，所述碱性缓冲溶液为pH＝7.8的碳酸钠/碳酸氢钠的缓冲液。本专利技术方法所述步骤3)中，作为本专利技术实施方案之一，有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、或它们的任意组合。作为本专利技术实施方案之一，所述步骤1)进一步包括：反应结束后加入的40～70mL，优选50mL水，用三次25mL的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。作为本专利技术实施方案之一，所述步骤2)进一步包括：反应结束后减压除去四氢呋喃，加入40～70mL，优选50mL的水，用三次25mL的二乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸。作为本专利技术实施方案之一，本专利技术方法不仅仅适用于雷公藤甲素，还包括WO2015/085447所公开的其他雷公藤甲素类似物。作为实施方式之一，本专利技术方法不仅适用于AS1411或Sgc8c的适配子，还包括其他末端为氨基修饰的所有适配子均可以用于本专利技术中。本专利技术方法中以上各原辅料的当量数及溶剂用量均为在以1当量的雷公藤甲素的用量为基础下的使用量。作为本专利技术实施方案之一，本专利技术方法包括如下步骤：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在乙腈中反应的反应式如下：2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯脱去烯丙酯的反应式如下：3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸与适配子反应的反应式如下：(注：带氨基的带状物为适配子)作为本专利技术实施方案之一，所述改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法包括：1)在三口圆底烧瓶中加入5～25mL二氯甲烷，雷公藤甲素(1当量)，丙炔酸烯丙酯(1～2.0当量，优选1.1～1.3当量)和三丁基膦(0.1～1.0当量，优选0.2～0.3当量)，在温度保持在20～30℃条件下搅拌反应4h后，加入的水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。2)在单口圆底本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的雷公藤甲素‑适配子偶合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸烯丙酯；2)3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉的作用下生成3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸；3)3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸在含水的有机溶剂中并在EDCI‑NHS和N‑羟基琥珀酰亚胺的作用下与溶于碱性缓冲溶液中的适配子反应生成适配子‑雷公藤甲偶合物。

【技术特征摘要】
1.一种改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯；2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉的作用下生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸；3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸在含水的有机溶剂中并在EDCI-NHS和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下与溶于碱性缓冲溶液中的适配子反应生成适配子-雷公藤甲偶合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中三丁基膦的量为0.1～1.0当量；丙炔酸烯丙酯的量为1～2.0当量；有机溶剂的量为5～25mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、1，1-二氯乙烷或二甲苯、或它们的任意组合。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量；吗啉的量为2～10当量；有机溶剂的量为10～40mL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中有机溶剂为四氢呋喃、甲苯，1，4二氧六环或二甲基亚砜，或它们的任意组合物。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中EDCI-NHS的量为1.1～2.0当量；N-羟基琥珀酰亚胺的量为1.1～2.0当量；有机溶剂的量为2～5mL；水的量为0.7～1.4mL；碱性缓冲溶液的量为1～4mL。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈、或它们的任意组合。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进一步包
\t括：反应结束后加入40～70mL的水，用三次25mL的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕爱平，张戈，鲁军，刘彪，党蕾，何小鹃，赵宁，姜淼，吕诚，
申请(专利权)人：中国中医科学院中医临床基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11