含有光不稳定保护基团的偶联剂及其在如固相载体官能化中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含有光不稳定保护基团的化合物，及其作为偶联剂在固相载体官能化中的应用。本发明专利技术还涉及由所述化合物官能化的固相载体，并涉及所述固相载体在诸如核酸分子等目标生物分子的固定中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种含有光不稳定保护基团的偶联剂及其在固相载体官能化中的应用。本专利技术还涉及利用这种偶联剂官能化的固相载体，并且涉及所述固相载体在目标生物分子，特别是核酸分子的固定中的应用。
技术介绍
人们提出了各种将目标生物分子，特别是例如寡核苷酸(ON)之类的核酸，共价移植在固相载体上的方法。在ON连接的具体内容中，这些方法可分成两个主要类别1.原位合成，其为通过亚磷酰胺途径的合成原理，在固相载体上逐步构建ON分子。在国际申请WO97/39151中经特别说明的这个方法，可以制备具有高密度ON的表面。另外，利用一组空白板，和光不稳定保护基团，使各种ON定位在载体上。然而，这种方法有不少主要的缺点。更具体而言，与载体连接的ON不能被表征，且很难引入带有修饰的ON。2.通过沉积或异位合成，其包括，首先，常规地制备ON，其次，利用合适的化学反应将ON连接至固相载体。第二种方法的优点特别在于所用的ON能够在其连接至固相载体前被表征。在下文中将特别说明的是关于本专利技术的沉积合成方法。在现有技术中已说明了多种利用沉积的合成方法，特别是有关用于使ON进行定位移植(localizing the grafting)的各种技术。首先，所提及的方法可以是利用电化学途径的方法，其包括固定(anchoring)ON，将该ON预先用例如吡咯基团之类的导电性基团通过吡咯残基的电聚合作用而官能化。在专利FR2703359中，特别说明了这种电化学ON沉积方法。尽管如此，此方法的缺陷在于需要使用导电性载体，使最终组分变得复杂。此外，在“Lab on a Chip”类组分中，各种制造步骤能够损害电极的质量，并因此损害其功能。其次，所提及的方法可以是光化学途径，其似乎是更令人满意的，这是由于表面及所用的化学溶液的处理(management)是具体化的(externalized)。开发了两个方案i.在表面和靶分子之间直接进行光移植。在此情况中，光移植的缺点在于涉及非选择性的自由基反应。ii.使在载体上光不稳定保护基团所保护的官能团游离，从而可其与靶ON随后的反应，以产生其连接。在此情况中，所用的载体通常由偶联剂官能化，该偶联剂是双官能化合物，其包括在其一末端的官能团用于与载体表面连接，以及在另一末端的官能团，其对含有互补化学官能团的靶分子有反应性，所述偶联剂的反应性官能团被光不稳定基团所保护。然而，为了竞争性，后面的方案必须满足一定的条件。以下是这些条件-活化的载体与靶分子之间的反应必须迅速；此反应只能够在偶联剂的反应性官能团从其保护基团游离时发生(活化反应)；-由此反应所得的产率必须要高；-用于制备偶联剂的合成方法必须简单易行，且包括尽量少的步骤；-使用温和的反应条件(例如水)；-偶联剂与靶分子之间形成的键必须要在各种温度和pH的条件下稳定，从而可非常灵活的使用由此官能化的载体。现在，到目前为止所提出的各种方法似乎都不能令人满意地完全满足这些条件，特别是由于所用的各种偶联剂的性质。因此，专利技术人给他们自己所定的目标在于提供一种新颖的双官能偶联剂，该偶联剂包括一个由光不稳定基团保护的反应性官能团，其由包括很少步骤且能够在温和条件下实施的方法而容易地合成，能够有利于使用这些偶联剂将固相载体官能化，为了使靶生物分子随后连接在该载体上。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一个主题是具有以下通式(I)的偶联剂A-X-B-Proc (I)其中-A表示用于与固相载体连接的官能团，所述官能团选自胺、亚磷酰胺、硅烷和活化的酯类的官能团；-X表示间隔臂(spacer arm)；-B是选自在光去保护后形成羟基胺(-ONH2)及其衍生物或酰肼(-NH-NH2)及其衍生物的反应性官能团，所述官能团B被Proc基团保护；-Proc是以下通式(II)的光不稳定保护基团 其中R1和R2可以相同或不同，其表示氢原子或C1-C4烷基。根据本专利技术，官能团A将根据待与通式(I)的偶联剂连接的载体的性质而选择。优选的活化的酯类官能团是用N-羟基丁二酰亚胺，或用其它本领域技术人员熟知的合适的活化剂(例如五氟苯)酯化的羧酸官能团。间隔臂X可以根据最终特性的需要而改变其长度和极性。例如，其可以是不带电的疏水链(例如饱和烃链)或其它例如乙二醇醚的不带电的亲水链。根据本专利技术的具体优选实施方式，间隔臂X选自包含1至13个碳原子的饱和烃链，或二醇醚，二醇醚的碳链包含4至12个碳原子，例如三乙二醇(TEG)和六乙二醇(HEG)。反应性官能团B是在光去保护后，可与具有至少一个互补化学官能团的靶分子共价连接的官能团。此反应性官能团B将能够与该靶分子所具有的互补官能团，例如胺官能团、醇、硫醇、羧基或羰基，相互作用。互补官能团对的更详尽列举可以容易地在任何有机化学专论中查找。在上述通式(II)的保护基团中，当表示烷基，互相独立的R1和R2优选选自甲基或乙基；特别最优选甲基。在上述通式(I)的偶联剂中，特别优选下列偶联剂，其中i.-A表示亚磷酰胺官能团，-X表示具有6个碳原子的饱和烃链，-B表示羟基胺官能团(-ONH-)，且-R1和R2表示氢原子或甲基；ii.-A表示三(C1-C4)烷氧基硅烷，-X表示具有2至12个碳原子的饱和烃链，-B表示羟基胺官能团(-ONH-)，且-R1和R2表示氢原子或甲基；iii.-A表示用N-羟基丁二酰亚胺或五氟苯酯化的羧酸官能团，-X表示-CH2-，-B表示羟基胺官能团(-ONH-)，且-R1和R2表示氢原子或甲基；在上述iii)定义的化合物中，最特别优选如下化合物，其中官能团A是三乙氧基硅烷，X是含有3个或11个碳原子的饱和烃链。上述通式(I)的偶联剂，可以根据本领域技术人员熟知的有机合成原理，且根据官能团A和B的性质，而容易地制备。根据本专利技术的第一个实施方式，当偶联剂是通式(I)的化合物，其中连接官能团A是例如N-羟基丁二酰亚胺酯形式活化的羧酸，并且官能团B是羟基胺官能团时，优选使用对应以下示意图1的制备方法示意图1 在此示意图中，Proc是上述通式(II)所定义的光不稳定保护基团，且X可以是具有与上述说明相同含义的间隔臂。根据此示意图，在第一步骤中，含有羧基官能团和羟基胺官能团的通式(III)化合物，受选自通式(II)的Proc光不稳定保护基团的保护，由此产生通式(IV)的化合物，然后，在第二步骤中，用N-羟基丁二酰亚胺将通式(IV)化合物的羧酸官能团活化，由此产生预期的通式(I)化合物。根据本专利技术的第二个实施方式，当偶联剂是通式(I)的化合物，其中连接官能团A是亚磷酰胺官能团，且官能团B是羟基胺官能团时，优选使用对应以下示意图2的制备方法 示意图2 在此示意图上，X和Proc具有如上述说明的相同含义，B表示羟基胺官能团而A表示以下基团。 其中，R和R’可以相同或不同，表示含有1个至13个碳原子的烷基。根据此示意图，在第一步中，通式(V)的卤代醇(其中Halo表示例如溴、氯、碘或氟的卤原子)与N-羟基邻苯二甲酰亚胺反应(卤原子的亲核取代)，由此获得通式(VI)的化合物，其在第二步中进行肼解作用，以获得游离的羟基胺官能团，其随后受选自通式(II)的光不稳定的Proc保护基团的保护，由此产生通式(VII)的化合物，其在第三步中，进行亚磷酸化作用(phosphityla本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种如下通式（Ⅰ）的偶联剂：Ａ－Ｘ－Ｂ－Ｐｒｏｃ（Ⅰ）其中：－Ａ表示用于与固相载体连接的官能团，所述官能团选自胺、亚磷酰胺、硅烷和活化的酯类的官能团；－Ｘ表示间隔臂；－Ｂ是选自在光去保护后，形成羟基胺（－ＯＮＨ↓［２］）及其衍生物或酰肼（－ＮＨ－ＮＨ↓［２］）及其衍生物官能团的反应性官能团，所述官能团Ｂ被Ｐｒｏｃ基团保护；－Ｐｒｏｃ是以下通式（Ⅱ）的光不稳定保护基团：＊＊＊（Ⅱ）其中：Ｒ↓［１］和Ｒ↓［２］可以相同或不同，其表示氢原子或Ｃ↓［１］－Ｃ↓［４］烷基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：安托万欧昂，弗朗索瓦丝维内，埃里克德弗朗斯科，帕斯卡尔迪米，
申请(专利权)人：原子能总署，约瑟夫傅立叶大学，
类型：发明
国别省市：FR[法国]