本发明专利技术公开了一种新颖的生物分子标记方法，即用一种含溶剂分子（水或乙腈）的环金属铱配位化合物通过与蛋白质或多肽中的组氨酸残基结合而形成一个荧光基团。该方法可以标记多肽和包括抗体在内的蛋白质等生物活性分子，并可进一步用于生物检测、细胞和组织标记、生物分子材料示踪等应用领域。由于这类化合物的荧光颜色丰富，且标记反应在常温和常规缓冲溶液中一步完成，因而比市场上通常使用的标记化合物及标记方法具有优势，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
该专利技术涉及一种新颖的生物标记方法，即通过一类自身无荧光的金属铱配位化合物与蛋白质上的组氨酸残基结合，形成可被激发的荧光基团，从而得以标记抗体分子，并用于免疫分析检测、免疫荧光成像等生物
技术介绍
生物分子的荧光标记是应用生物技术中的重要组成部分，被荧光基团标记的生物分子如抗体、多肽及核酸等通过分子间相互作用，识别目标分子，后通过高灵敏的光学方法或电化学方法(光致发光、荧光共振能量转移、时间分辨、电化学发光)获取标记分子产生的信号，以此形成一系列基于荧光标记的检测手段，被广泛地应用于各种生命科学基础研究、临床医学诊断、食品卫生安全等领域。常见的荧光标记物包括有机小分子(如罗丹明和荧光素等)、无机过渡金属配位化合物(如三联吡啶钌)，以及金属和半导体纳米颗粒(如量子点)等，这些材料可以通过化学修饰的手段，在其上引入可被活化的化学基团，通过共价交联方式标记生物分子。 蛋白质和多肽的表面分布着大量较活泼的化学基团，例如a-氨基(-NH》、羧基(-C00H)、巯基(-SH)和羟基(-0H)等。其中，位于蛋白质N末端或赖氨酸残基侧链末端的a-氨基，以及位于半胱氨酸残基侧链末端的巯基最常被用于同标记化合物或交联剂(crosslinker)交联1。同a -氨基发生反应的基团包括经过1-乙基-(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后的羧基，或者是其进一步与氮羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成的较稳定的活性琥珀酰亚胺酯中间体，两者皆可与氨基交联形成稳定的肽键；另外，氨基也可以同异硫氰酸基团(-N = C = S)发生定量反应并以硫脲键进行交联。同巯基发生反应的包括马来酰亚胺基团，含有该基团的交联剂可以与蛋白质上的巯基形成稳定的硫醚键。以上这些反应方式目前应用比较广泛，有些需要在交联基团的活化过程中添加额外的试剂，这就意味着需要更多的反应步骤和时间来完成标记；有些商业销售的标记化合物则被预先活化以方便用户，但这些化合物受到稳定性和反应条件的限制，不能长期保存。此外，在实际工作中，以上提到的标记基团的可选择性比较有限，通常在被标记物中进行一种类型的标记(如_NH2同-COOH或-SH的交联反应)之后，即难以进行第二，以至第三种标记。 组氨酸由于其侧链的咪唑基团上的两个N原子各含有一对孤电子，因而具有较强的与二价金属离子(如2!1++， Ni++， Cu++)的配位能力，这一特性在许多研究和应用中得到验证。比如，人血液中存在有一种富组氨酸的糖蛋白(histidine-rich glycoprotein,HRG)，在pH和Zn++浓度的调节下，HRG上组氨酸通过与Zn++的络合，引起一系列蛋白结构的变化和信号转导，最终引发细胞凋亡，抑制血管的生成2。又如，6联组氨酸序列(His6)与附++的络合能力被研究者开发成为一种使用极为广泛的蛋白质表达纯化手段，德国QIAGEN公司开发的用于纯化和检测His6标签蛋白的试剂盒，即利用了组氨酸与Ni-NTA可逆的高亲和力相互作用w。在此基础上，通过在Ni-NTA上交联荧光基团，Hise序列与Ni-NTA的高亲和力也被发展用于HiSe标签蛋白的荧光标记，但所报道的这些标记基团在结合蛋白前后没有荧光强度的改变，不仅需要序列中包含连续的6个组氨酸残基，且荧光标记结构庞大，应用受到限制45。组氨酸与Cu++的络合能力也被广泛地研究，其中有研究者利用含共轭芳香环的化合物与铜离子结合，制备成为一种荧光探针，利用竞争置换法检测溶液中游离的组氨酸，该方法虽然灵敏度较高，但从其反应原理上(置换法)无法进行多肽和蛋白质的标记6。 本专利技术的特色是利用新型的过渡金属铱配位化合物，直接地、特异性地标记多肽和蛋白质(抗体)中的单个组氨酸残基，标记前后荧光强度大大增强，形成的荧光基团分子量小，标记过程简单快速，形成的产物化学性质稳定，光学性质优良，可以广泛用于免疫检测、分子示踪等领域。
技术实现思路
本专利技术是利用一类环金属铱配位化合物，对抗体、多肽等蛋白质进行标记，
技术实现思路
包括标记过程与分析方法，以及标记产物用于进一步的生物分析。 两个此类化合物的结构如式I所示。 (式工) 其中m卯y代表2_ (p-tolyl) pyridine (2-(对甲苯基)妣啶)，bt代表2-phenylbenzothiazolate(2-(苯基)苯并噻唑)，0Tf代表Trifluoromethanesulfonate(三氟甲基磺酸根)，Ls。lv代表易于从中心金属脱离的溶剂分子，比如水或乙腈。 本专利技术的主要优点在于 1)利用环金属铱配位化合物与蛋白质的单个组氨酸残基(Histidine)结合进行标记，标记产物稳定、不可逆。作为一种新颖的交联方式，提供除了 (_C00H，-NH2，-SH)交联基团之外的另一种选择。 2)所使用的标记反应是通过组氨酸残基与金属配位化合物络合，反应在常温、常用的缓冲溶液中进行，不需要额外的交联试剂，操作步骤简单。 3)大多数的荧光标记物在与生物分子结合之前就已具备荧光，标记前后，荧光标记物的发光特性不会有明显的改变。而本专利技术所使用的金属配位化合物在与蛋白质的组氨酸残基结合之前仅有极微弱的荧光，标记后形成的复合物则有明显的荧光增强，从而集化学交联和荧光标记于一步之中。 4)环金属配位化合物具有较好的光稳定性、较长的荧光寿命等光物理学特性，此外用于高灵敏度的电化学发光检测将是此类化合物的另一重要优势。 5)环金属铱配位化合物性质稳定，在常规条件下以固体或溶液形式可以长时间保存。 6)该专利技术中的环金属铱配位化合物与组氨酸残基形成的发光基团能够被从紫外到蓝光的任何波长所激发。 7)该专利技术中的环金属铱配位化合物与组氨酸残基形成的发光基团也能够通过电化学发光的方式激发，产生与光致发光同样的发射。 本专利技术尤其突出的特点和优势在于可用于抗体分子的快速高效标记。即便来源物种不同，抗体分子IgG通常具有相似的结构，其上含有的组氨酸残基也通常在10 20个左右，且多分布于分子表面，易于标记。例如图1所示的是一个小鼠源的IgG分子晶体结构，其上突出显示的组氨酸残基共有28个。附图说明 图1是小鼠源的IgG分子晶体结构，其上的组氨酸残基被突出显示。 图2中1，2，3，4分别代表四种化合物L-组氨酸，组胺，尿刊酸和咪唑，左侧显示四种化合物的结构，右侧显示其各自与铱配位化合物 (0Tf)反应后在紫外灯照射下产生荧光的结果。 图3是(mppy)2Ir与组氨酸形成的发光基团结构示意图。 图4是铱配位化合物同组氨酸结合前后吸收光谱的变化。 图5是在328nm紫外光激发下产生的荧光发射光谱，最高发射峰在490nm，次峰在515nm。 图6是两种多肽(左KQEASGSTA和右KQEAflGSTA)分别与(OTf)反应后在紫外灯照射下产生荧光的结果。 图7是含组氨酸的多肽结合铱配位化合物后在328nm紫外光激发下产生的荧光发射光谱。 图8是(mppy)2Ir与多肽或蛋白质肽链序列中的组氨酸形成的发光基团结构示意图。其中加深显示的为肽链的主链结构，Rn'和Rn各自代表肽链中组氨酸残基上游和下游的氨基酸侧链残基。 图9是(1)兔抗羊IgG在PBS中，(2)兔抗羊IgG中加入铱配位化合物，(3)铱配位化合物在PBS中，在紫外灯照射本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型生物标记方法，该方法使用一类由两个相同的Ｃ＾Ｎ二齿配体以及两个溶剂分子配位络合的环金属铱配位化合物标记抗体、多肽和蛋白质，被标记对象的氨基酸序列中至少含有一个组氨酸残基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：费浩，周明，贾俊丽，王小波，黄泽柱，
申请(专利权)人：苏州纳凯科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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