测定奥贝胆酸片溶出含量的方法技术

本发明专利技术公开了测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件为：0～3分钟，流动相A为60～80(V％)，流动相B为40～20(V％)；3～10分钟，流动相A线性增加至80～100(V％)，流动相B减少至20～0(V％)；10～12分钟，流动相A为80～100(V％)，流动相B为20～0(V％)；12～15分钟，流动相A为60～80(V％)，流动相B为40～20(V％)；(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对待测样品溶液进行检测。该方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效测定奥贝胆酸片溶出含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学分析领域，具体而言，本专利技术涉及一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法。
技术介绍
奥贝胆酸(ObeticholicAcid)又名6-乙基鹅去氧胆酸，是人初级胆汁酸中鹅脱氧胆酸(CDCA)的一种新型衍生物，为法尼酯衍生物X受体(FXR)的天然配体。奥贝胆酸属法尼醇X受体激动剂，通过活化法尼醇X受体，间接抑制细胞色素7A1(CYP7A1)的基因表达。由于CYP7A1是胆酸生物合成的限速酶，因此奥贝胆酸可以抑制胆酸合成，用于治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。奥贝胆酸由美国Intercept制药公司研发成功，是二十年来首个研发用于治疗胆汁淤积性肝病的药物。用于那些对旧标准治疗药物熊去氧胆酸没有充分应答或不能耐受的患者。奥贝胆酸的结构式如下：由于其缺乏共轭结构，无紫外吸收特征，无法用紫外可见分光光度法对其进行准确的测定。有报道采用蒸发光散射检测器(ELSD)对胆酸类含量进行测定，但这种方法只适用于样品溶液中不含有盐类成分的供试品，而对于奥贝胆酸片溶出的样品无法进行测定(因为其溶出介质是缓冲盐溶液)。也有报道采用HPLC紫外末端吸收法分析胆酸类片剂的溶出度，但由于奥贝胆酸片规格比较小，溶出的供试品溶液浓度低，采用此法也无法准确对其进行定量测定。目前，尚未见有关奥贝胆酸片溶出含量的检测方法。而实现奥贝胆酸片的溶出含量分析，对于制剂过程的质量控制方面具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，该检测方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效测定奥贝胆酸片溶出含量。在本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，该方法的测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：采用加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；其中，所述梯度洗脱条件为：时间(min)流动相A(V％)流动相B(V％)060～8040～20360～8040～201080～10020～01280～10020～01560～8040～20(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对所述待测样品溶液进行检测，以便得到所述待测样品溶液中奥贝胆酸的含量。由此，根据本专利技术实施例的测定奥贝胆酸片溶出含量的方法可以对奥贝胆酸片的溶出含量进行快速高效测定，从而可以有效控制制剂的质量，并且该检测方法专属性强、精密度高、线性良好、准确度高，可有效控制药品的质量。另外，根据本专利技术实施例的测定奥贝胆酸片溶出含量的方法还可以具有以下附加技术特征：根据本专利技术实施例，采用磷酸将所述流动相B的pH调节为1.5～5.0，优选为3.0。由此，可进一步改善峰形，提高分离度。根据本专利技术实施例，所述衍生化试剂选自吡啶-苯甲酰氯、邻苯二甲醛、4-硝基苯甲酰甲基溴、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、对肽内酰胺苯磺酰氯和2-乙酰溴-6-甲氧基萘中的至少一种，优选为2-乙酰溴-6-甲氧基萘和4-硝基苯甲酰甲基溴。根据本专利技术实施例，所述催化剂选自18-冠醚-6和三乙胺中的至少一种，优选18-冠醚-6。根据本专利技术实施例，所述奥贝胆酸片的试剂量为100～500ul、温度为35～65℃、时间为30～100min，优选试剂量250ul、温度45℃、时间40min。由此可以节约时间和成本。根据本专利技术实施例，所述有机溶剂为选自甲醇和乙腈中的至少一种，优选为乙腈。由此，得到的峰形最好。根据本专利技术实施例，所述梯度洗脱条件为：时间/min流动相A(V％)流动相B(V％)0604036040108020128020156040其中，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为酸性水溶液。由此，可以进一步提高分离度。根据本专利技术实施例，所述梯度洗脱的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。根据本专利技术实施例，检测波长为255～275nm，优选为265nm。由此，可以显著提高检测灵敏度。根据本专利技术实施例，所述待测样品溶液进样体积为10～50μl，优选为20μl。本专利技术所述的测定方法，可以依照以下方法实现：(1)取待测样品(奥贝胆酸片)适量，加4-硝基苯甲酰甲基溴和18-冠醚-6各250ul，在45℃下反应40min，配制成每1ml含10ug的待测样品溶液；(2)设置梯度洗脱的流速为1.0ml/min，检测波长265nm；(3)取步骤(1)中的所述待测样品溶液10～50μl，优选20μl，注入高效液相色谱仪，完成奥贝胆酸含量的测定。本专利技术方法的检测限度可达3ng，能有效准确的检测出样品中的奥贝胆酸含量。同时本专利技术通过利用柱前衍生和HPLC梯度洗脱，得到的色谱图基线平稳，峰形好，无拖尾，杂质也可以被有效分离，检测灵敏度高，另外该分析方法分析效率高，整体分析过程仅需15分钟。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显。附图说明图1：按照实施例1条件检测的衍生化空白的HPLC图；图2：按照实施例1条件检测的自制原料药奥贝胆酸10ug/ml的HPLC图；图3：按照实施例2条件检测的辅料空白衍生化的HPLC图；图4：按照实施例2条件检测的自制原料药奥贝胆酸20ng的HPLC图；图5：按照实施例2条件检测的自制奥贝胆酸片溶出溶液10ug/ml的HPLC图；图6：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-1的HPLC图；图7：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-2的HPLC图；图8：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-3的HPLC图；图9：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-4的HPLC图；图10：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-5的HPLC图；图11：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性-6的HPLC图；图12：按照实施例3条件检测的自制奥贝胆酸线性图；图13：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率50％的HPLC图；图14：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率100％的HPLC图；图15：按照实施例4条件检测的自制奥贝胆酸片回收率130％的HPLC图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本专利技术实施例中所用的奥贝胆酸原料药和奥贝胆酸片为专利技术人自制。其中奥贝胆酸片是由奥贝胆酸原料药与辅料(微晶纤维素、羧甲淀粉钠、硬脂酸镁)经过制剂制备工艺获得。实施例1仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，1210紫外检测器色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(150×4.6mm,5μm)；流动相A：甲醇流动相B：水溶液(用磷酸调节pH至3.0)梯度洗脱：时间/min流动相A(V％)流动相B(V％)0703037030109010129010157030流速：1.0ml/min检测波长：265nm进样体积：20μl运行时间：15分钟实验步骤：供试品溶液：精密称取奥本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，其特征在于，测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，其中，所述梯度洗脱条件为：时间(min)流动相A(V％)流动相B(V％)060～8040～20360～8040～201080～10020～01280～10020～01560～8040～20(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对所述待测样品溶液进行检测，以便得到所述待测样品溶液中奥贝胆酸的含量。

【技术特征摘要】
1.一种测定奥贝胆酸片溶出含量的方法，其特征在于，测定条件包括：(1)待测样品溶液的配制：加入衍生化试剂和催化剂对奥贝胆酸片进行衍生化后配制待测样品溶液；(2)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以有机溶剂为流动相A，酸性水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，其中，所述梯度洗脱条件为：时间(min)流动相A(V％)流动相B(V％)060～8040～20360～8040～201080～10020～01280～10020～01560～8040～20(3)检测分析：采用高效液相色谱仪对所述待测样品溶液进行检测，以便得到所述待测样品溶液中奥贝胆酸的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用磷酸将所述流动相B的pH调节为1.5～5.0，优选为3.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化试剂选自吡啶-苯甲酰氯、邻苯二甲醛、4-硝基苯甲酰甲基溴、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素、对肽内酰胺苯磺酰氯和2-乙酰溴-6-甲氧基萘中的至少一种，优选为2-乙酰溴-6-甲氧基萘和4-硝基苯甲酰甲基溴。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：付友珍，贾田，刘大鹏，王晓星，钱丽娜，
申请(专利权)人：中美华世通生物医药科技武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42