一种利用遗传工程改造的酵母发酵生产糖的方法技术

一种将淀粉水解产物发酵成非乙醇发酵产物的发酵方法，其中所述淀粉水解产物含有基于总碳水化合物的60‑98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3‑5重量％的异麦芽糖。该方法包括：a)形成含有淀粉水解产物和经遗传修饰的微生物的发酵液，该经遗传修饰的微生物含有i)编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的外源基因，ii)编码能将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；和b)发酵所述发酵液的所述淀粉水解产物以产生非乙醇发酵产物。该发酵方法可以作为单步发酵或分批式方法进行。所述经遗传修饰的微生物含有编码催化除乙醇之外的产物形成的酶的外源基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】创建于2015年6月18日，大小为133kb的标题为“N00258WO01_Sequence_Listing.txt”的ASCII文本文件的全部内容通过引用并入本文。专利技术概述本专利技术涉及一种发酵糖的方法和能够进行这种发酵的酵母。更具体地，本专利技术涉及一种使用遗传工程改造的酵母发酵糖的方法和这种经遗传修饰的酵母。
技术介绍
商业上大规模使用发酵方法生产有机分子，例如乙醇、柠檬酸和乳酸。在这些方法中，将碳水化合物饲喂给能够将其代谢成所需的发酵产物的生物体。碳水化合物和生物体一起选择，使得生物体能够高效地消化碳水化合物以获得产率良好的目标产物。在这些方法中使用遗传工程改造的生物体以便优化产量和工艺变量或者代谢特定碳水化合物变得越来越普遍。淀粉是可广泛获得且廉价的碳水化合物来源。其可以从多种植物来源中获得，如玉米、小麦、水稻、大麦等。许多生物体不能直接代谢淀粉，或者缓慢、低效地代谢淀粉。因此，通常在将淀粉加入发酵过程之前先对其进行处理，将其分解成生物体可以容易地发酵的单糖。通常，淀粉被水解成主要包括葡萄糖(即右旋糖)的混合物。然而，完全水解成葡萄糖显著增加了成本，因此大多数市售的葡萄糖产品往往含有少量的各种寡聚多糖。不幸的是，许多生物体也不能代谢这些寡聚物，导致浪费了这些碳水化合物的价值。
技术实现思路
异麦芽糖是在制备具有高葡萄糖浓度的淀粉水解产物原料的方法中可能产生的组分。已经证实异麦芽糖是特别不希望存在的组分，特别是在本专利技术方法发酵淀粉水解产物来源的葡萄糖以形成发酵产物的后期阶段。虽然不受理论束缚，但是据信异麦芽糖可以干扰产物产率，不仅通过阻止异麦芽糖的两种葡萄糖单体组分的发酵，还通过与最终发酵产物发生反应。异麦芽糖可以与发酵产物反应形成例如酯和其它化学品，其通过异麦芽糖的多个可用羟基官能团的反应形成。例如，如果产物是氨基酸，异麦芽糖可能通过美拉德反应与产物反应并产生引起褐变的化学化合物。因此，在发酵方法结束时存在的每种异麦芽糖化合物具有降低所需最终发酵产物的产量和/或质量的倍增效应。尽管可以向淀粉水解产物中加入酶以使异麦芽糖转化为葡萄糖，但是已经发现，将该酶加入到具有高葡萄糖浓度的淀粉水解产物中倾向于使该酶失活。本专利技术提供了一种简洁有效的发酵具有高葡萄糖浓度的淀粉水解产物的方式。现已发现，葡萄糖致使异麦芽糖酶失活的问题可以利用在发酵方法中使用含有编码能够将异麦芽糖转运到微生物中的转运蛋白的基因，和编码能够在该微生物中将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的基因的微生物解决。因此，这种微生物能够吸收存在于发酵液中的异麦芽糖并通过内部产生的酶将异麦芽糖转化为葡萄糖——所有这些都发生在细胞内，其中葡萄糖的局部浓度足够低以允许酶的有效操作。同样地，通过将酶隔离在微生物中有效地使酶免于在最终的发酵产物是酸时产生的不期望的低pH条件。一些酵母天然地包含编码能够将异麦芽糖转运到该微生物中的转运蛋白的基因，以及编码能够在该微生物中将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的基因(例如酿酒酵母)。其他酵母缺乏一种或这两种基因并且不消耗异麦芽糖(例如伊萨酵母属的酵母)。但是即使对于天然包含这一或两种基因的酵母，这样的酵母通常不能以有效的速率在葡萄糖耗尽时消耗掉发酵液中存在的所有异麦芽糖。因此，即使对于天然消耗异麦芽糖的酵母，本专利技术人惊奇地发现，仍然期望在该微生物中表达编码能够将异麦芽糖转运到微生物中的转运蛋白的外源基因，和/或编码能够将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因，以增加微生物对异麦芽糖的消耗。在第一实施方案中，进行一种将淀粉水解物发酵成非乙醇发酵产物的发酵方法，所述淀粉水解产物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖。该方法包括：a)形成含有淀粉水解产物和经遗传修饰的微生物的发酵液，所述经遗传修饰的微生物含有i)编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的外源基因；ii)编码能够在该微生物中将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；b)发酵所述发酵液中的所述淀粉水解产物以产生非乙醇发酵产物。在第二实施方案中，进行一种用于将淀粉水解物发酵成非乙醇发酵产物的分批发酵方法，所述淀粉水解物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖。该方法包括：a)形成含有待发酵的淀粉水解产物总量的第一部分和经遗传修饰的微生物的发酵液，所述微生物包括i)编码能够将异麦芽糖转运到该微生物中的转运蛋白的外源基因，ii)编码能够在该微生物中将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；b)在初始发酵步骤中，发酵发酵液中所述淀粉水解产物的第一部分以产生发酵产物；c)将待发酵的淀粉水解物总量另外的至少一部分补料到所述发酵液中，该淀粉水解物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖，其中在该步骤(c)期间，所述发酵液平均具有50g/l或更小的葡萄糖浓度；和d)产生含有发酵产物的最终发酵液。在一个实施方案中，如上所述的经遗传修饰的微生物含有编码催化除乙醇之外的产物形成的酶的外源基因。在本专利技术的一些优选方面，在遗传工程改造的微生物或遗传工程改造的酵母的基因组中存在编码能够运输异麦芽糖的转运蛋白的外源基因的一个活性拷贝。本专利技术的发酵方法特别适用于制备用于非食品应用的发酵产物。这是因为本专利技术的方法可用于提供具有少量的不期望的残余成分或杂质的发酵产物，所述残余成分或杂质允许存在于食品中但在某些非食品应用中是不可接受的。附图说明图1是显示实施例8的发酵期间异麦芽糖的消耗的图。图2是显示实施例10的发酵期间乳酸产量的图。专利技术详述下面描述的本专利技术的实施例不旨在穷举或将本专利技术限制为以下详细描述中公开的精确形式。相反，所选择和描述的实施方案的目的是使得本领域技术人员能够方便地领会和理解本专利技术的原理并实践本专利技术。通过混合淀粉水解产物、水和支持发酵生物生长所需的营养物并接种适于实施本文所述的期望的发酵方法的经遗传修饰的生物体来制备发酵液。在本专利技术发酵方法中，使用淀粉水解产物作为起始原料。淀粉可以从任何合适的淀粉来源获得，例如玉米、小麦、水稻、大麦、马铃薯、木薯等。本专利技术方法中使用的淀粉水解产物优选从经过液化和糖化以获得高浓度葡萄糖的淀粉中获得。这种水解产物中碳水化合物的平衡由不同浓度的麦芽糖、异麦芽糖、潘糖和其它DP3和DP4(即葡萄糖的寡聚物)或更大的葡萄糖寡聚物组成。这种淀粉水解物是用于本专利技术的特别优选的发酵底物。在本专利技术的方法中，用于发酵方法的淀粉水解产物包含基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖(例如，基于总碳水化合物0.4-5重量％、0.5-3重量％、和0.7-2.5重量％的异麦芽糖)。在另一个在实施方案中，用于发酵方法的淀粉水解物含有基于总碳水化合物的80-98重量％的葡萄糖，基于总碳水化合物的85-98重量％的葡萄糖或基于总碳水化合物的90-97重量％的葡萄糖。在上述任何其他的葡萄糖含量实施方案中，用于本专利技术发酵方法的淀粉水解产物包含基于总碳水化合物计0.3-5重量％的异麦芽糖，或基于总碳水化合物0.4-5重量％，0.5-3重量％和0.7-2.5重量％的异麦芽糖。任一上文示出的葡萄糖含量的实施方案中，如果异本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将淀粉水解产物发酵成非乙醇发酵产物的发酵方法，所述淀粉水解产物含有基于总碳水化合物的60‑98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3‑5重量％的异麦芽糖，该方法包括：a)形成含有淀粉水解产物和经遗传修饰的微生物的发酵液，所述经遗传修饰的微生物含有i)编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的外源基因；ii)编码能将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；b)发酵所述发酵液中的所述淀粉水解产物以产生非乙醇发酵产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.18 US 62/013,9961.一种用于将淀粉水解产物发酵成非乙醇发酵产物的发酵方法，所述淀粉水解产物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖，该方法包括：a)形成含有淀粉水解产物和经遗传修饰的微生物的发酵液，所述经遗传修饰的微生物含有i)编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的外源基因；ii)编码能将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；b)发酵所述发酵液中的所述淀粉水解产物以产生非乙醇发酵产物。2.一种用于将淀粉水解产物发酵成非乙醇发酵产物的分批发酵方法，所述淀粉水解产物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖，该方法包括：a)形成含有待发酵的淀粉水解产物总量的第一部分和经遗传修饰的微生物的发酵液，所述经遗传修饰的微生物含有i)编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的外源基因；ii)编码能将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的外源基因；b)在初始发酵步骤中，发酵所述发酵液中的所述第一部分淀粉水解产物以产生发酵产物；c)将待发酵的淀粉水解物总量的另外一部分补料到所述发酵液中，所述淀粉水解物含有基于总碳水化合物的60-98重量％的葡萄糖和基于总碳水化合物的0.3-5重量％的异麦芽糖，其中在该步骤(c)期间发酵液平均具有50g/l或更低的葡萄糖浓度；和d)产生含有发酵产物的最终发酵液。3.权利要求2的发酵方法，其中在步骤(c)期间，发酵液平均具有40克/l或更低的葡萄糖浓度。4.权利要求2的发酵方法，其中在步骤(c)期间，发酵液平均具有30g/l或更低的葡萄糖浓度。5.权利要求2的发酵方法，其中在步骤(c)期间，发酵液平均具有约5至约15g/L的葡萄糖浓度。6.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物含有编码催化除乙醇之外的产物形成的酶的外源基因。7.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物是酵母。8.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物是克拉布特里阴性酵母。9.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物是克鲁维(Kluyveromyes)属酵母或伊萨酵母(Issatchenkia)属的酵母。10.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物是东方伊萨酵母/发酵毕赤酵母(I.orientalis/P.fermentans)进化枝的酵母。11.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物含有编码能够转运异麦芽糖的转运蛋白的异源基因和编码能将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶的异源基因。12.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述经遗传修饰的微生物包含PDC缺失。13.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中由所述经遗传修饰的微生物产生的用于将异麦芽糖转化为葡萄糖的酶对于将麦芽糖转化为葡萄糖也具有活性。14.根据前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵液在活性发酵过程中的某点具有小于4.8的pH。15.根据前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵液在活性发酵过程中的某点具有小于4.5的pH。16.根据前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵液在活性发酵过程中的某点具有小于4的pH。17.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵液在活性发酵过程中的某点具有小于3.5的pH。18.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中步骤c)进行的时间段为约4至约30小时。19.权利要求2-18中任一项的发酵方法，其中在补料步骤期间，在步骤c)中淀粉水解产物总量的剩余部分使用可变速率添加系统补料到发酵液中。20.前述权利要求和权利要求25中任一项的发酵方法，其中所述发酵产物选自由氨基酸、有机酸、醇、多元醇、脂肪酸、脂肪酸烷基酯(例如脂肪酸甲基酯(例如C6至C12脂肪酸甲酯或乙酯(优选C8至C10脂肪酸甲酯)))、单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯及其混合物组成的组。21.前述权利要求和权利要求25中任一项的发酵方法，其中所述发酵产物选自由氨基酸和有机酸组成的组。22.前述权利要求和权利要求25中任一项的发酵方法，其中所述发酵产物包含有机酸。23.前述权利要求中任一项的发酵方法，其中所述发酵产物选自由乳酸、柠檬酸、丙二酸、羟基丁酸、己二酸、赖氨酸、酮-戊二酸、戊二酸、3-羟基-丙酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、粘康酸、甲基丙烯酸、乙酸、己酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯、十二烷酸甲酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯及其混合物组成的组。24.权利要求2-23中任一项的发酵方法，还包括在步骤c)期间添加至少一种将异麦芽糖转化为葡萄糖的活性酶。25.权利要求1的发酵方法，还包括添加至少一种将异麦芽糖转化为葡萄糖的活性酶。26.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·M·布拉迪，C·K·米勒，
申请(专利权)人：嘉吉公司，
类型：发明
国别省市：美国;US