一种巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法技术

本发明专利技术提供一种巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，该方法包括将含有巯嘌呤甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物；通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述巯嘌呤甲基转移酶的酶活力。该方法具有方便、快捷和高灵敏度的特点，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，同时又属于临床诊断和检测领域。具体而言，本专利技术提供了一种测定巯嘌呤甲基转移酶(TPMT，thiopurineS-methyltransferase，EC2.1.1.67)酶活力的方法。
技术介绍
巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)是一种专门催化芳香族和杂环化合物的巯基甲基化反应的胞内酶，该酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸作为甲基供应者，催化芳香族和杂环化合物的硫原子甲基化。TPMT最初是在鼠的肾脏和肝脏中发现的，后来发现在多数组织中均有分布，如心、血细胞、胎盘、胰腺、小肠等，而且在人的这些组织及红细胞中也发现了TPMT。TPMT结构和生物活性具有多态性。人类红细胞内TPMT活性与肝、肾、白细胞、急性淋巴母细胞性白血病的淋巴细胞的TPMT活性是呈正相关的，因而红细胞成为测定TPMT最容易得到的组织。根据Klemetsdal的报道，不同人种红细胞的TPMT活性存在差异，如挪威北部莎弥人的TPMT活性高于该地区非莎弥的白种人；在美国佛罗里达州，黑人的TPMT活性比白人低33％，但黑人和白人中高活性、中等活性的比例是一致的；新加坡华人的TPMT活性高于美国人。随着分子生物学技术的发展，现已发现TPMT基因存在多态性，该基因突变与酶缺陷存在密切关系。如在TPMT缺陷的病人中发现的第一种突变(称为TPMT2)是第80位密码子改变，即发生了G238→C颠换，由此导致丙氨酸80→脯氨酸，使TPMT活性上百倍地下降；发现的另一种突变(称为TPMT3)是在TPMT的ORF出现了两个核苷酸的转换，即G460→A和A719→G，导致相应的氨基酸由丙氨酸154→苏氨酸和酪氨酸240→半胱氨酸，使细胞内TPMT蛋白的含量下降，可比野生型低400倍，从而导致该酶缺陷。巯基嘌呤类药物在临床上已使用多年，主要用于白血病和肿瘤的化疗、器官移植受者的免疫抑制治疗以及自身免疫性疾病的治疗。常用的药物为6-巯基嘌呤(MP)、6-硫鸟嘌呤(TG)和咪唑硫嘌呤(AT)。MP用于治疗急性淋巴母细胞白血病(ALL)已40多年，至今仍是ALL治疗方案中不可缺少的药物。而AT则已成为免疫抑制治疗的三联药物之一，已广泛用于肾移植病人。近来报道还可用于治疗自身免疫性肝炎且效果良好。TPMT活性与临床上使用的巯基嘌呤类药物的代谢有重要关系。巯基嘌呤类药物在体内的代谢主要有两条途径，一是在TPMT的催化下使硫基甲基化，二是在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化成硫尿酸。由于造血组织中缺乏黄嘌呤氧化酶，该组织中的嘌呤类药物主要靠TPMT催化分解，因而TPMT缺陷的病人，如果使用了常规剂量的MP、AT和TG时，则会引起巯基嘌呤类药物在体内堆积，而且主要影响造血系统，轻者引起中毒和影响治疗效果，重者可致死亡。因此在接受巯基嘌呤类药物治疗之前进行TPMT的酶活力检测或者相关基因检测具有重要意义，通过检测可以及时发现此类患者并积极调整剂量实现安全有效的治疗。目前TPMT酶活力检测的方法有两种，较常用的是非螯合的放射化学法(简称放射化学法)。放射化学法测定TPMT活性的基本原理是利用该酶的转甲基作用，以14C标记的S-甲基14C-腺苷-甲硫氨酸(14-SAM)为标记甲基的供者，在RBC溶解物中TPMT的催化下使MP接受14C标记的甲基，再以液体闪烁计数测定DPM值，最后计算TPMT活力。另一种是HPLC法检测TPMT活性，原理与放射法相同，最终通过HPLC检测MMP或类似物的含量反馈TPMT的活力。综合上述两种检测方法来看，放射法的前期处理较复杂，对技术要求较高且易造成污染，而HPLC法对设备要求较高，操作相对复杂，检测周期也较长；上述两种方法的特点均不利于推广使用。
技术实现思路
因此，基于上述已有技术的缺陷，为了解决现有巯嘌呤甲基转移酶(TPMT，thiopurineS-methyltransferase，EC2.1.1.67)的酶活力检测方法不易推广的问题，本专利技术的目的是提供一种快速、特异、准确可靠的TPMT酶活力检测方法。采用该方法可以在半自动或全自动的分析检测设备上使用，而且检测灵敏度高，特异性高，操作简便，因而可以得到切实的推广使用。针对上述专利技术目的，本专利技术是通过下述技术方案实现的：本专利技术提供了一种巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)酶活力检测方法，所述方法包括：(1)将含TPMT的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)和甲基受体接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)和甲基受体的甲基化产物，(2)通过将所述SAH与SAH水解酶相接触以生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)，采用光度计评估所述Ado的产生速率以检测所述样本中所述TPMT的酶活力。优选地，根据前述的TPMT酶活力检测方法，其中，所述甲基受体选自带巯基的芳香族化合物和带巯基的杂环化合物中的一种或两种。优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、巯基嘌呤类似物和巯基嘌呤衍生物中的一种或多种。更优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷酸、硫肌苷单磷酸盐、硫肌苷三磷酸盐、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、巯基乙醇、溴苯硫酚、邻氨基苯硫醇、氯苯硫酚、氟苯硫酚、硫代苯甲酸和巯基嘌呤核苷酸中的一种或多种。最优选为6-硫鸟嘌呤。更优选地，根据前述的TPMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：(1)所述含TPMT的样本、所述SAM和所述甲基受体混合并反应获得反应液1；(2)将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶加入步骤(1)中的所述反应液1中并反应，获得反应液2；(3)将步骤(2)中所述的反应液2离心获得上清液；(4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或直接地评估所述Ado的产生速率以检测所述样本中所述TPMT的酶活力。再优选地，根据前述的TPMT酶活力检测方法，其中，所述方法包括：在步骤(1)过程和步骤(2)过程中加入缓冲液。优选地，所述缓冲液为乙酸钠/乙酸、柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢盐/柠檬酸(盐)、磷酸盐、柠檬酸/氢氧化钠/盐酸、2-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES)、3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或多种。最优选为磷酸钾缓冲液。还优选地，根据前述的TPMT酶活力检测方法，其中，所述缓冲液为10～1000mmol/L，优选为25～100mmol/L，最优选为30mmol/L；所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将含巯嘌呤甲基转移酶的样本与S‑腺苷‑L‑甲硫氨酸和甲基受体接触以形成S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物，(2)通过将所述S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸与S‑腺苷‑L‑同型半胱氨酸水解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述巯嘌呤甲基转移酶的酶活力。

【技术特征摘要】
1.一种巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，其特征在于，所述方法包
括：
(1)将含巯嘌呤甲基转移酶的样本与S-腺苷-L-甲硫氨酸和甲基受体
接触以形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基受体的甲基化产物，
(2)通过将所述S-腺苷-L-同型半胱氨酸与S-腺苷-L-同型半胱氨酸水
解酶相接触以生成高半胱氨酸和腺苷，采用光度计评估所述腺苷的产生速
率以检测所述样本中所述巯嘌呤甲基转移酶的酶活力。
2.根据权利要求1所述的巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，其特征
在于，所述甲基受体选自带巯基的芳香族化合物和带巯基的杂环化合物中
的一种或两种；优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、巯基嘌呤类似物和
巯基嘌呤衍生物中的一种或多种；更优选地，所述甲基受体选自巯基嘌呤、
咪唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷酸、硫肌苷单磷酸盐、硫肌苷三
磷酸盐、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、巯基乙醇、溴苯硫酚、邻氨基苯硫醇、
氯苯硫酚、氟苯硫酚、硫代苯甲酸和巯基嘌呤核苷酸中的一种或多种；最
优选为6-硫鸟嘌呤。
3.根据权利要求2所述的巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，其特征
在于，所述方法包括：
(1)所述含巯嘌呤甲基转移酶的样本、所述S-腺苷-L-甲硫氨酸和所
述甲基受体混合并反应获得反应液1；
(2)向步骤(1)中的所述反应液1中加入所述S-腺苷-L-同型半胱氨
酸水解酶并反应，获得反应液2；
(3)将步骤(2)中所述的反应液2离心获得上清液；
(4)采用光度计检测步骤(3)中所述的上清液的光吸收值，间接或
直接地评估所述腺苷的产生速率以检测所述样本中所述巯嘌呤甲基转移酶
的酶活力。
4.根据权利要求3所述的巯嘌呤甲基转移酶酶活力检测方法，其特征
在于，所述方法包括：在步骤(1)过程和步骤(2)过程中加入缓冲液；
优选地，所述缓冲液选自乙酸钠/乙酸、柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸氢盐/柠檬
酸(盐)、磷酸盐、柠檬酸/氢氧化钠/盐酸、2-吗啉代乙磺酸缓冲液、3-吗啉

\t丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、Tris-盐酸、硼酸-硼砂缓冲液
中的一种或多种；最优选为磷酸钾缓冲液。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天泽，菅晓勇，
申请(专利权)人：北京中科唯新生物医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11