一种定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法及其应用，属生物医药技术领域。该方法采用4-乙酸-7,8-二羟基香豆素为COMT酶的特异性探针底物，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性。本发明专利技术不仅可用于不同来源生物样本中COMT酶活的定量评估，还可用于体外快速筛选COMT的抑制剂并评估其抑制能力。该方法可用于各类体外生物样品中COMT酶真实活力的定量评估，实现抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；可用于评价不同种属COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突变体的催化活性，进而评估其代谢儿茶酚类药物的能力。本发明专利技术方法具有(1)高选择性，(2)廉价易得；(3)高灵敏度等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法及其应用。
技术介绍
儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)是哺乳动物体内广泛分布的一种甲基化转移酶，其主要生理功能是负责代谢内源性的神经递质(如肾上腺素，去甲肾上腺素以及多巴胺等)和外源性的儿茶酚类药物(如卡比多巴，苄丝肼，阿扑吗啡，多巴酚丁胺，非诺多泮，α-甲基-L-DOPA，异丙肾上腺素和利米特罗等)。在人体中，COMT酶有两种存在形式，一种是溶解性的COMT(S-COMT)，另一种是膜结合型的COMT(MB-COMT)。COMT在人体的多种组织中都有分布，如肾脏，肝脏，肺等，在人体的大脑中，主要存在于突触后神经元。在人体的大多数组织中，而S-COMT的量是MB-COMT的3-4倍左右。在人脑中，COMT酶主要以MB-COMT的形式存在，占总量的70％，S-COMT占30％。COMT酶的活性在人体中呈基因多态性，分别表现为低活性(COMTLL)，中等活性(COMTLH)和高活性(COMTHH)。有研究表明，人体中的COMT活性和疼痛，乳腺癌及一些精神类疾病都有相关性。当人脑中的COMT活性偏高时，大脑中前额叶皮质中的神经递质多巴胺清除增加，认知能力削弱，导致精神分裂症的发生；而大脑中的COMT活性偏低时，则容易造成强迫症，焦虑症，恐慌症以及对疼痛的敏感。当人乳腺中COMT活性偏低时，雌二醇等雌激素无法代谢，其高暴露直接导致乳腺癌的发生。因此，定量测定人体组织及细胞中的COMT活性对于多种疾病的临床诊断和治疗具有重要指导意义。另外，由于COMT还是帕金森病治疗的一个重要靶点，利用COMT定量评价方法并借助体外代谢孵育体系可高通量的筛选和评价COMT抑制剂，对于帕金森病治疗药物的发现意义重大。目前，最常用的COMT酶活性的检测方法是采用原儿茶酸，左旋多巴，多巴胺或肾上腺素作为底物，利用高效液相色谱或质谱对其甲基化产物进行定量，从而评估COMT酶的活性。由于色谱或质谱方法成本昂贵，样品分析时间较长，因此难以实现样品的高通量检测。此外，以上检测方法中所用的探针底物包括原儿茶酸在哺乳动物COMT酶的催化下分别生成两个单甲基化产物，而两个产物由于结构和理化性质相近，在液相色谱上通常难以分离，给其定量检测带来了不便。因此，急需寻找定量方便，检测灵敏的COMT酶活性评价方法。目前，COMT的体外评价体系主要包括哺乳动物的红细胞，以及亚细胞组分等，其中亚细胞组分主要包括肝脏组织的S9、胞浆以及脑组织匀浆等成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(SAM)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的COMT酶活性进行表征。本专利技术中所用的COMT底物4-乙酸-7,8-二羟基香豆素具有代谢产物单一(仅生成一个8-O-甲基化产物)、代谢路径单一(只被COMT催化，不发生葡萄糖醛酸化和磺酸化反应)、代谢产物易于检测且灵敏度高等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法及其应用，该方法中所用的探针底物没有荧光发射，而甲基化产物具有较强的荧光发射，荧光量子产率较高易于检测。利用该方法可对多种生物体系中COMT的分布和功能进行定量评价。本专利技术提供了一种定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法，该方法采用4-乙酸-7,8-二羟基香豆素作所示为探针底物，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性；所述4-乙酸-7,8-二羟基香豆素探针底物的结构式为：采用4-乙酸-7,8-二羟基香豆素作为COMT的特异性底物进行8-O-甲基化结合反应，通过定量检测单位时间内的8-O-甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中COMT的活性；具体测定方法为：a.体系中以4-乙酸-7,8-二羟基香豆素作为探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。b.在Tris-HCl缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；c.在反应体系中还需加入镁离子及甲基供体，其中4-乙酸-7,8-二羟基香豆素、镁离子及甲基供体的物质量的比为：1:1000:40；反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的8-O-甲基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；d.测定单位时间内8-O-甲基化产物生成量作为COMT活性的评价指标。所述甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸。所述生物体系为含有儿茶酚-O-甲基转移酶或其突变体的各类体外生物样品；包括重组表达COMT单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系。步骤b中优选37℃为最优反应时间；优选pH7.4为最优反应pH值。所述方法中所用的探针底物不具有荧光属性，而其8-O-甲基化产物具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；8-O-甲基化产物荧光检测条件为：激发波长320nm，最大发射波长为520nm(如图4所示)。所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性方法的应用，该方法可用于各类体外生物样品中COMT酶真实活力的定量评估，以及在诱导剂或激活剂存在条件下COMT酶残余活性的定量测定，进而实现抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性方法的应用，该探针底物还可用于评价不同种属COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突变体的催化活性，进而评估其代谢儿茶酚类药物的能力。该方法中的特异性探针底物为off-on型荧光探针，其在COMT活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组COMT、人及动物组织制备液及各类组织细胞中COMT酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体COMT的探针底物，评估代谢酶COMT的个体及种属差异。该方法中所用的8-O-甲基化代谢产物的荧光检测方法还可用于COMT抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。采用重组COMT单酶，人肝胞浆孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验(如图6所示)，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明4-乙酸-7,8-二羟基香豆素可特异性的经COMT代谢，生成8-O-甲基化产物(如图7所示)。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该检测方法具有非常良好的灵敏性。作为高灵敏性的COMT酶活性的定量检测方法，该方法可以用来检测COMT酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的COMT的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的S-9、胞浆等制备物中COMT的活性标定。选用本专利技术所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法检测COMT酶体外活性具有以下突出优势：(1)高选择性：4-乙酸-7,8-二羟基香豆素可被COMT高选择性地代谢成一个代谢产物，即本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量测定儿茶酚‑O‑甲基转移酶活性的方法，其特征在于：该方法采用4‑乙酸‑7,8‑二羟基香豆素作为探针底物，该底物可被COMT酶专一性催化生成8‑甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性；所述4‑乙酸‑7,8‑二羟基香豆素探针底物的结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法，其特征在于：该方法采用4-
乙酸-7,8-二羟基香豆素作为探针底物，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-
甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定
COMT的活性；所述4-乙酸-7,8-二羟基香豆素探针底物的结构式为：
2.按照权利要求1所述的定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法，其特征还
在于：采用4-乙酸-7,8-二羟基香豆素作为COMT的特异性底物进行8-O-甲基化
结合反应，通过定量检测单位时间内的8-O-甲基化产物的生成率来定量测定不
同生物体系中COMT的活性；具体测定方法为：
a.体系中以4-乙酸-7,8-二羟基香豆素作为探针底物；底物浓度选择1/10～10
Km；
b.在Tris-HCl缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间；孵育体系pH介于
5.5～10.5之间，；
c.在反应体系中还需加入镁离子及甲基供体，其中4-乙酸-7,8-二羟基香豆
素、镁离子及甲基供体的物质量的比为：1:1000:40；反应时间为5～120分钟，
确保以上底物相应的8-O-甲基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终
止反应；
d.测定单位时间内8-O-甲基化产物生成量作为COMT活性的评价指标。
3.按照权利要求2所述的定量测定儿茶酚-O-甲基转...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，夏杨柳，葛广波，王平，钱星凯，窦同意，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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